РНК-покрытие для кормления C. elegans: Метод, чтобы вызвать целевое выражение dsRNA в кишечной палочке

- В C. elegans, РНК может быть вызвано кормления червей бактерий, которые выражают двухструнные РНК или dsRNA из рекомбинантной плазмиды ДНК.

Для начала вырастить тетрациклин-резистентный HT115 E. coli, трансфицированный с L4440 плазмид ночью на селективных пластинах LB агара, содержащих тетрациклин и ампициллин, или его функциональный аналоговый карбенициллин. В дополнение к целевой ДНК, плазмид содержит ген для ампициллина.

Далее, урожай бактерий колоний и расширить их в жидкой среде LB до нужной концентрации. Чтобы вызвать экспрессию dsRNA, передать раствор бактерий на подготовленные нематоды роста среды, или NGM, агар пластин, содержащих IPTG.

В этой системе выражения IPTG имитирует лактозу для инактивации лак-репрессора, позволяющего экспрессию полимеразы T7 РНК. На плазмиде экспрессия ДНК цели регулируется двумя конвергентными промоутерами T7. Следовательно, последовательности чувств и анти-чувства транскрибируются, ведущие к выражению dsRNA.

Наконец, червь использует информацию о последовательности из попадает dsRNA для downregulate эндогенных mRNAs с дополнительными последовательностями. В этом эксперименте, мы будем готовить РНК пластин с трансгенной кишечной палочки для C. elegans кормления.

- Для пластин РНК загрузите 6-сантиметровые пластины с агаром NGM, содержащим iPTG и карбенициллин. Пусть они высохнут в течение 24-48 часов при комнатной температуре в темное время суток. Затем перенесите их на 4 градуса Цельсия на срок до 14 дней.

Далее, полоса селективных пластин, содержащих карбенициллин и тетрациклин с клонами бактерий РНК с L4440 плазмид проведения lin-53 гена. Используйте трехэта фазу полос картины и не забудьте пластины пустой вектор управления. Затем, расти пластины ночь на 37 градусов по Цельсию.

На следующий день, выбрать по крайней мере три одиночные колонии и привить каждую из них в отдельную трубку культуры с 2 миллилитров LB дополнен карбенициллин, но не тетрациклин. План иметь три здоровых культур в состоянии.

Далее, расти культуры ночь на 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут оптической плотности на 600 нанометров от 0,6 до 0,8. Затем, добавить 500 микролитров каждой бактериальной культуры на 6-сантиметровый NGM агар РНК пластин. Incubate пластин на ночь при комнатной температуре в темноте.