Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ב- C. elegans, RNAi יכול להיגרם על ידי האכלת תולעים חיידקים המבטאים RNA דו גדילי או dsRNA מ פלסמיד DNA רקומביננטי.
כדי להתחיל, לגדל טטרציקלין עמיד HT115 E. coli transfected עם L4440 פלסמיד לילה על לוחות אגר LB סלקטיבי המכילים טטרציקלין ואמפצילין, או carbenicillin אנלוגי פונקציונלי שלה. בנוסף ל- DNA היעד, פלסמיד מכיל גן עבור עמידות א ampicillin. רק מושבות חיידקים היורשים את הפלסמיד יכול לגדול
לאחר מכן, לקצור מושבות חיידקים ולהרחיב אותם בינוני LB נוזלי לריכוז הרצוי. כדי לגרום ביטוי dsRNA, להעביר את פתרון החיידקים על מדיום צמיחה נמטודה מוכן, או NGM, צלחות אגר המכיל IPTG.
במערכת ביטוי זו, IPTG מחקה לקטוז כדי להשבית את מדכא הלק המאפשר את הביטוי של T7 RNA פולימראז. על פלסמיד, ביטוי DNA היעד מוסדר על ידי שני מקדמי T7 מתכנסים.
לבסוף, התולעת משתמשת במידע הרצף מן dsRNA לבלוע כדי downregulate mRNAs אנדוגני עם רצפים משלימים. בניסוי זה, נכין לוחות RNAi עם מהונדס E. coli עבור C. elegans האכלה.
- עבור צלחות RNAi, לטעון צלחות 6 ס"מ עם אגר NGM המכיל IPTG ו carbenicillin. תן להם להתייבש במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר מכן, פס צלחות סלקטיבית המכיל carbenicillin ו טטרציקלין עם שיבוטים חיידק RNAi עם L4440 פלסמיד נושא את הגן לין-53.
למחרת, לבחור לפחות שלוש מושבות בודדות לחסן כל אחד מהם לתוך צינור תרבות נפרדת עם 2 מיליליטר של LB בתוספת קרבניצילין, אבל לא טטרציקלין.
לאחר מכן, לגדל את התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 0.6 כדי 0.8. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של כל תרבות חיידקית ל 6 ס"מ NGM אגר RNAi צלחת.
