RNAi Plating for C. elegans Feeding: En teknik til at fremkalde Target dsRNA-udtryk i E. coli

Overview

Denne video beskriver principperne bag RNAi behandling i C. elegans og viser en protokol til knockdown lin-35 i en transgen orm stamme.

Protocol

Denne protokol er uddrag fra Kolundzic, et al, Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret Transskribering Factor Expression at omprogrammere kimceller til neuroner i C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Løsningsforberedelse
   1. NGM-Agar plader (1 L)
      1. Der tilsættes 3 g NaCl, 2,5 g peptonmedier (f.eks. Bacto-Peptone) og 20 g agar. Efter autoklavering tilsættes 1 ml kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH-lager), 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO₄og 1 ml amphotericin B (2,5 mg/mL lager).
   2. NGM-Agar RNAi plader (1 L)
      1. Tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g peptonemedier og 20 g agar. Efter autoklavering tilsættes 1 mL kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH-bestand), 1 mL på 1 M MgSO₄, 1 mL af 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K₂PO_4,1 ml amphotericin B (2,5 mg/mL lager), 1 ml 1 M IPTG og 1 ml karburator (50 mg/mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Der tilsættes 10 g peptonmedier, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL af 1 M Tris pH 8.0. Tilføj H₂O til 1 L. Efter autoklavering tilsættes 1 mL på 50 mg/mL carbenicillin og 2,5 mL på 5 mg/mL tetracyklin.
   4. LB-mellem (1 L)
      1. Der tilsættes 10 g peptonmedier, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl og 10 mL 1 M Tris pH 8.0. Tilføj H₂O til 1 L. Efter autoklavering tilsættes 1 mL på 50 mg/mL carburenicillin.
   5. M9-buffer (1 L)
      1. Der tilsættes 6,0 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO_4,5 g NaCl og 50 mg gelatine. Før brug tilsættes 1 mL 1 M MgSO₄.
   6. Blegningsopløsning (10 ml)
      1. Der tilsættes 1 mL NaClO og 2 mL af 5 N NaOH. Tilsæt H2O til 10 mL.
2. Fremstilling af RNAi plader
   BEMÆRK: C. elegans dyrkes typisk i laboratoriet på 6 cm Petri plader indeholdende 7,5 mL Nematode Growth Medium Agar (NGM-Agar). Denne protokol er optimeret til orme, der opbevares ved 15 °C. For at forberede plader med NGM skal du bruge standard sterile teknikker til at forhindre svampe- og bakterieforurening. Følgende er protokollen til fremstilling af NGM plader suppleret med reagenser til RNAi.
   1. Der fremstilles 6 cm NGM-Agar RNAi plader indeholdende 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 50 μg/mL carbenicillin. Lad dem tørre i 24 – 48 timer ved stuetemperatur i mørke¹².
      1. RNAi-pladerne holdes ved 4 °C i mørke. Må ikke bruges, hvis du er ældre end 14 dage.
   2. Vælg RNAi-bakterierne (Escherichia coli HT115) klon, der indeholder L4440 plasmid med lin-53-gen-DNA-sekvensen fra den frosne glycerolbestand fra det tilgængelige RNAi-bibliotek på LB-agarplader, der indeholder 50 μg/mL carbenicillin og 12,5 μg/mL tetracyklin ved hjælp af trefaset stribemønster. Bakterierne dyrkes ved 37 °C natten over. Denne klon tillader IPTG-afhængig produktion af lin-53 dsRNA i bakterierne.
      1. Derudover vokse RNAi bakterier, der indeholder L4440 plasmid uden gensekvens som den tomme vektor kontrol.
   3. Den næste dag skal du vælge en enkelt koloni fra lin-53 eller tomme vektor LB-agar plader ved hjælp af en 200 μL pipettespids og pode hver af dem i et separat dyrkningsrør indeholdende 2 mL flydende LB medium suppleret med 50 μg/mL carbenicillin. Dyrke kulturer natten over ved 37 °C, indtil de når en optisk tæthed (OD) ved 600 nm på 0,6 – 0,8. Mål OD ved hjælp af et spektrofotometer.
      ADVARSEL: De flydende LB-medier bør ikke indeholde tetracyklin i modsætning til den LB-agarplade, der bruges til stribe af bakterierne fra glycerolbestanden, da medtagelse af tetracyklin under fodring fører til en nedsat RNAi-effektivitet.
   4. Der tilsættes 500 μL af hver bakteriekultur(lin-53 eller tom vektor) til 6 cm NGM-Agar RNAi plader ved hjælp af en multipipette. Inkuber plader med et lukket låg natten over ved stuetemperatur i mørke for at tørre. I løbet af denne tid vil IPTG i NGM-pladerne fremkalde produktion af dsRNA i bakterierne.
      1. Brug mindst 3 plader pr bakteriekultur pr. forsøg. Dette vil give 3 tekniske replikater for hvert eksperiment.
   • Der opbevares tørrede NGM-agar RNAi-plader med bakterier ved 4 °C i mørke i op til to uger.
3. Forberedelse af C. elegans Strain BAT28
4. Hold ormen stamme BAT28 indeholder transgener otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] og NTIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50 bakterier ved hjælp af standard NGM-Agar plader ved 15 °C.
   BEMÆRK: For detaljeret protokol om Nematode kultur, se. Rol-6(su1006) er en dominerende allel og almindeligt anvendte fænotypiske injektion markør^16, der forårsager den typiske rullende bevægelse. Det bruges i otIs305 transgene til at spore hsp-16.2prom::che-1.
   1. BAT28-stammen skal altid holdes ved 15 °C for at forhindre prækautiv aktivering af hsp-16.2prom::che-1 transgenet. Reducer eksponeringen for temperaturer over 15 °C, mens belastningen håndteres så meget som muligt.
5. Hvis du vil alderssynkronisere orme, skal du bruge blegningsteknikken.
   1. 6 cm NGM-Agar-plader, der indeholder voksne og æg af BAT28, vaskes af med 900 μL M9-buffer. Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
   2. Tilsæt 0,5 – 1 ml blegemiddelopløsning, og ryst røret i ca. 1 minut, indtil de voksne orme begynder at briste åbne. Skærm ved hjælp af et standard stereomikroskop.
   3. Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
   4. Ormpillen vaskes 3 gange ved at tilsætte 800 μL M9-buffer og centrifugering ved 900 x g.
   5. Placer de rensede æg på friske NGM-plader seedet med OP50 bakterier. Der dyrkes en bleget population på OP50-bakterier ved 15 °C, indtil de når L4-trin (ca. 4 dage). L4 larver kan genkendes af en hvid plet omtrent halvvejs langs ormens ventrale side ved hjælp af et standard stereomikroskop.
      BEMÆRK: For at opnå kimcellen til neuronkonverteringsfænotype ved udtømning af lin-53, skal den være udtømt i forældregenerationen (P0). Scoringen for konverterings-fænotypen foretages i den følgende generation (filialgeneration F1). For at opnå den nedbrydende lin-53, der allerede er i P0, udsættes L4-dyr for RNAi.
6. Overfør manuelt 50 L4-stadieorm pr. replikat ved hjælp af en platintråd til en NGM-plade, der ikke indeholder bakterier, og lad orme bevæge sig væk fra overførte OP50-bakterier. Lad orme bevæge sig på pladen i ca. 5 minutter. Brug bakterier fra NGM-Agar RNAi plader tidligere seedet med lin-53 RNAi bakterier (eller tomme vektor kontrol) til at overføre til de respektive RNAi plader.
   1. Undgå at overføre OP50 bakterier til de faktiske RNAi plader. Arbejd hurtigt for at minimere belastningens eksponeringstid for temperaturer over 15 °C.
7. Inkuber orme på NGM-Agar RNAi plader ved 15 °C i ca 7 dage, indtil F1 afkom af ormene når L3 - L4 fase. De kan være tydeligt adskilt fra P0 dyr, da de er større og tykkere end F1 afkom.
   1. Visuelt kontrollere under et standard stereomikroskop, om F1-afkomorme viser den fremspringende vulva (pvul) fænotype som vist i figur 1. RNAi mod lin-53 har pleiotropiske virkninger og forårsager pvul phenotype, som kan bruges til at vurdere, om RNAi mod lin-53 har været en succes.
      BEMÆRK:  RNAi mod lin-53 kan også forårsage dødelighed af F1 embryoner. Denne effekt øges, hvis pladerne udsættes for højere grader end 15 °C, før dyrene når L3 – L4-trinsfasen. Døde embryoner kan genkendes af arresteret udvikling og mangel på udklækning.
   2. Inkuber plader i mørke, da IPTG er lysfølsom.

Representative Results

Figur 1: Pvul phenotype forårsaget af RNAi mod lin-53. (Øverst) DIC billede af L4/unge voksne fase F1 afkom orme stammer fra kontrol eller lin-53 RNAi behandlede mødre. Skalastænger = 20 μm. (Nederst) Dyr behandlet med lin-53 RNAi udviser den fremspringende vulva (pvul) fænotype (sorte pilehoveder). Den pvul phenotype bekræfter, at RNAi mod lin-53 var en succes. Skalalinjer = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654