Denne protokol er uddrag fra Kolundzic, et al, Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret Transskribering Factor Expression at omprogrammere kimceller til neuroner i C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).
- Løsningsforberedelse
-
NGM-Agar plader (1 L)
- Der tilsættes 3 g NaCl, 2,5 g peptonmedier (f.eks. Bacto-Peptone) og 20 g agar. Efter autoklavering tilsættes 1 ml kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH-lager), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4og 1 ml amphotericin B (2,5 mg/mL lager).
-
NGM-Agar RNAi plader (1 L)
- Tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g peptonemedier og 20 g agar. Efter autoklavering tilsættes 1 mL kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH-bestand), 1 mL på 1 M MgSO4, 1 mL af 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4,1 ml amphotericin B (2,5 mg/mL lager), 1 ml 1 M IPTG og 1 ml karburator (50 mg/mL).
-
LB-Agar (1 L)
- Der tilsættes 10 g peptonmedier, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL af 1 M Tris pH 8.0. Tilføj H2O til 1 L. Efter autoklavering tilsættes 1 mL på 50 mg/mL carbenicillin og 2,5 mL på 5 mg/mL tetracyklin.
-
LB-mellem (1 L)
- Der tilsættes 10 g peptonmedier, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl og 10 mL 1 M Tris pH 8.0. Tilføj H2O til 1 L. Efter autoklavering tilsættes 1 mL på 50 mg/mL carburenicillin.
-
M9-buffer (1 L)
- Der tilsættes 6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4,5 g NaCl og 50 mg gelatine. Før brug tilsættes 1 mL 1 M MgSO4.
-
Blegningsopløsning (10 ml)
- Der tilsættes 1 mL NaClO og 2 mL af 5 N NaOH. Tilsæt H2O til 10 mL.
- Fremstilling af RNAi plader
BEMÆRK: C. elegans dyrkes typisk i laboratoriet på 6 cm Petri plader indeholdende 7,5 mL Nematode Growth Medium Agar (NGM-Agar). Denne protokol er optimeret til orme, der opbevares ved 15 °C. For at forberede plader med NGM skal du bruge standard sterile teknikker til at forhindre svampe- og bakterieforurening. Følgende er protokollen til fremstilling af NGM plader suppleret med reagenser til RNAi.
-
Der fremstilles 6 cm NGM-Agar RNAi plader indeholdende 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 50 μg/mL carbenicillin. Lad dem tørre i 24 – 48 timer ved stuetemperatur i mørke12.
- RNAi-pladerne holdes ved 4 °C i mørke. Må ikke bruges, hvis du er ældre end 14 dage.
-
Vælg RNAi-bakterierne (Escherichia coli HT115) klon, der indeholder L4440 plasmid med lin-53-gen-DNA-sekvensen fra den frosne glycerolbestand fra det tilgængelige RNAi-bibliotek på LB-agarplader, der indeholder 50 μg/mL carbenicillin og 12,5 μg/mL tetracyklin ved hjælp af trefaset stribemønster. Bakterierne dyrkes ved 37 °C natten over. Denne klon tillader IPTG-afhængig produktion af lin-53 dsRNA i bakterierne.
- Derudover vokse RNAi bakterier, der indeholder L4440 plasmid uden gensekvens som den tomme vektor kontrol.
- Den næste dag skal du vælge en enkelt koloni fra lin-53 eller tomme vektor LB-agar plader ved hjælp af en 200 μL pipettespids og pode hver af dem i et separat dyrkningsrør indeholdende 2 mL flydende LB medium suppleret med 50 μg/mL carbenicillin. Dyrke kulturer natten over ved 37 °C, indtil de når en optisk tæthed (OD) ved 600 nm på 0,6 – 0,8. Mål OD ved hjælp af et spektrofotometer.
ADVARSEL: De flydende LB-medier bør ikke indeholde tetracyklin i modsætning til den LB-agarplade, der bruges til stribe af bakterierne fra glycerolbestanden, da medtagelse af tetracyklin under fodring fører til en nedsat RNAi-effektivitet.
-
Der tilsættes 500 μL af hver bakteriekultur(lin-53 eller tom vektor) til 6 cm NGM-Agar RNAi plader ved hjælp af en multipipette. Inkuber plader med et lukket låg natten over ved stuetemperatur i mørke for at tørre. I løbet af denne tid vil IPTG i NGM-pladerne fremkalde produktion af dsRNA i bakterierne.
- Brug mindst 3 plader pr bakteriekultur pr. forsøg. Dette vil give 3 tekniske replikater for hvert eksperiment.
- Der opbevares tørrede NGM-agar RNAi-plader med bakterier ved 4 °C i mørke i op til to uger.
- Forberedelse af C. elegans Strain BAT28
- Hold ormen stamme BAT28 indeholder transgener otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] og NTIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50 bakterier ved hjælp af standard NGM-Agar plader ved 15 °C.
BEMÆRK: For detaljeret protokol om Nematode kultur, se. Rol-6(su1006) er en dominerende allel og almindeligt anvendte fænotypiske injektion markør16, der forårsager den typiske rullende bevægelse. Det bruges i otIs305 transgene til at spore hsp-16.2prom::che-1.
- BAT28-stammen skal altid holdes ved 15 °C for at forhindre prækautiv aktivering af hsp-16.2prom::che-1 transgenet. Reducer eksponeringen for temperaturer over 15 °C, mens belastningen håndteres så meget som muligt.
- Hvis du vil alderssynkronisere orme, skal du bruge blegningsteknikken.
- 6 cm NGM-Agar-plader, der indeholder voksne og æg af BAT28, vaskes af med 900 μL M9-buffer. Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
- Tilsæt 0,5 – 1 ml blegemiddelopløsning, og ryst røret i ca. 1 minut, indtil de voksne orme begynder at briste åbne. Skærm ved hjælp af et standard stereomikroskop.
- Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
- Ormpillen vaskes 3 gange ved at tilsætte 800 μL M9-buffer og centrifugering ved 900 x g.
- Placer de rensede æg på friske NGM-plader seedet med OP50 bakterier. Der dyrkes en bleget population på OP50-bakterier ved 15 °C, indtil de når L4-trin (ca. 4 dage). L4 larver kan genkendes af en hvid plet omtrent halvvejs langs ormens ventrale side ved hjælp af et standard stereomikroskop.
BEMÆRK: For at opnå kimcellen til neuronkonverteringsfænotype ved udtømning af lin-53, skal den være udtømt i forældregenerationen (P0). Scoringen for konverterings-fænotypen foretages i den følgende generation (filialgeneration F1). For at opnå den nedbrydende lin-53, der allerede er i P0, udsættes L4-dyr for RNAi.
- Overfør manuelt 50 L4-stadieorm pr. replikat ved hjælp af en platintråd til en NGM-plade, der ikke indeholder bakterier, og lad orme bevæge sig væk fra overførte OP50-bakterier. Lad orme bevæge sig på pladen i ca. 5 minutter. Brug bakterier fra NGM-Agar RNAi plader tidligere seedet med lin-53 RNAi bakterier (eller tomme vektor kontrol) til at overføre til de respektive RNAi plader.
- Undgå at overføre OP50 bakterier til de faktiske RNAi plader. Arbejd hurtigt for at minimere belastningens eksponeringstid for temperaturer over 15 °C.
- Inkuber orme på NGM-Agar RNAi plader ved 15 °C i ca 7 dage, indtil F1 afkom af ormene når L3 - L4 fase. De kan være tydeligt adskilt fra P0 dyr, da de er større og tykkere end F1 afkom.
- Visuelt kontrollere under et standard stereomikroskop, om F1-afkomorme viser den fremspringende vulva (pvul) fænotype som vist i figur 1. RNAi mod lin-53 har pleiotropiske virkninger og forårsager pvul phenotype, som kan bruges til at vurdere, om RNAi mod lin-53 har været en succes.
BEMÆRK: RNAi mod lin-53 kan også forårsage dødelighed af F1 embryoner. Denne effekt øges, hvis pladerne udsættes for højere grader end 15 °C, før dyrene når L3 – L4-trinsfasen. Døde embryoner kan genkendes af arresteret udvikling og mangel på udklækning.
- Inkuber plader i mørke, da IPTG er lysfølsom.
