РНК-покрытие для кормления C. elegans: Метод, чтобы вызвать целевое выражение dsRNA в кишечной палочке

Overview

Это видео описывает принципы лечения РНК в C. elegans и демонстрирует протокол к нокдаун лин-35 в трансгенном штамме червя.

Protocol

Этот протокол выдержки из Kolundzic, и др., Применение РНК и теплового шока индуцированной транскрипции фактор выражения перепрограммировать зародышевые клетки нейронов в C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Подготовка решения
   1. Пластины NGM-Agar (1 л)
      1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептона (например, Бакто-Пептоне) и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в 95% акций EtOH), 1 мл 1 мл МГСО_4,1 мл 1 М CaCl2, 25 мл 1 М К2ПО₄и 1 мл амфотерицина В (2,5 мг/мл бульона).
   2. NGM-Агар РНК пластины (1 л)
      1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептона и 20 г агара. После автоклавирования добавить, 1 мл холестерина (5 мг/мл в 95% акций EtOH), 1 мл 1 m MgSO₄, 1 мл 1 M CaCl2, 25 мл 1 m K₂PO₄, 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл бульона), 1 мл 1 M IPTG и 1 мл карбенициллина (50 мг/мл).
   3. LB-Агар (1 л)
      1. Добавьте 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 20 г агара, 10 мл 1 м Tris pH 8.0. Добавить H₂O к 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл и 2,5 мл тетрациклина 5 мг/мл.
   4. LB Средний (1 л)
      1. Добавьте 10 г пептонового мультимедиа, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 10 мл 1 м Tris pH 8.0. Добавить H₂O к 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл.
   5. M9-буфер (1 л)
      1. Добавьте 6,0 г Na₂HPO₄, 3 г KH₂PO₄, 5 г NaCl, и 50 мг желатина. Перед использованием добавьте 1 мл 1 M MgSO₄.
   6. Отбеливающий раствор (10 мл)
      1. Добавьте 1 мл NaClO и 2 мл 5 N NaOH. Добавьте H2O до 10 мл.
2. Подготовка РНК-плит
   ПРИМЕЧАНИЕ: C. elegans обычно культури в лаборатории на 6 см Петри пластин, содержащих 7,5 мл nematode роста среднего агара (NGM-Агар). Этот протокол оптимизирован для червей, которые хранятся при 15 градусах Цельсия. Для приготовления пластин с NGM используйте стандартные стерильные методы для предотвращения грибкового и бактериального загрязнения. Ниже приводится протокол по подготовке NGM пластин, дополненных реагентами для РНК.
   1. Приготовьте 6-сантиметровые пластины NGM-Agar RNAi, содержащие 1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и карбенициллин 50 мкг/мл. Дайте им высохнуть на 24 - 48 ч при комнатной температуре в темное время суток¹².
      1. Храните РНК пластины при 4 градусов по Цельсию в темноте. Не используйте, если старше 14 дней.
   2. Выберите бактерии РНК(Escherichia coli HT115) клон, содержащий плазмиду L4440 с последовательностью генной ДНК lin-53 из замороженного запаса глицерола из доступной библиотеки РНК на пластинах LB-agar, содержащих карбенициллин 50 мкг/мл и 12,5 мкг/мл тетрациклина с помощью трехэтафного узора. Выращиваем бактерии при 37 градусах Цельсия за ночь. Этот клон позволяет IPTG-зависимого производства лин-53 dsRNA в бактериях.
      1. Кроме того, растут бактерии РНК, которые содержат плазмид L4440 без какой-либо последовательности генов в качестве пустого контроля вектора.
   3. На следующий день, выбрать одну колонию из лин-53 или пустой вектор LB-агар пластин с помощью 200 йл наконечник пипетки и привить каждый из них в отдельную культурную трубку, содержащую 2 мл жидкой среды LB дополнены 50 мкг / мл карбенициллина. Выращиваем культуры на ночь при 37 градусах Цельсия, пока не достигнут оптической плотности (ОД) при 600 нм 0,6 - 0,8. Измерьте OD с помощью спектрофотометра.
      ВНИМАНИЕ: Жидкие средства LB не должны содержать тетрациклин в отличие от пластины LB-агара, используемой для полоски бактерий из запасов глицерола, так как включение тетрациклина во время кормления приводит к снижению эффективности РНК.
   4. Добавьте 500 МКЛ каждой бактериальной культуры(лин-53 или пустой вектор) к 6 см NGM-Agar РНК пластин с помощью мультипайетта. Инкубировать пластины с закрытой крышкой на ночь при комнатной температуре в темноте, чтобы высохнуть. В течение этого времени IPTG в ngM пластин будет стимулировать производство dsRNA в бактериях.
      1. Используйте по крайней мере 3 пластины на бактериальную культуру за эксперимент. Это обеспечит 3 технических репликации для каждого эксперимента.
   • Храните высушенные ngM-агарные РНК пластины с бактериями при 4 градусах Цельсия в темноте до двух недель.
3. Подготовка C. elegans Штамм BAT28
4. Поддерживайте штамм червя BAT28, содержащий трансгены otIs305 и hsp-16.2prom::che-1, rol-6 (su1006)и ntIs1 «Gcy-5prom::gfp»на op50 бактерий, использующих стандартные пластины NGM-Agar при 15 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол о культуре Нематод см. rol-6 (su1006) является доминирующим аллель и широко используется фенотипический маркер инъекции^16, что вызывает типичные движения прокатки. Используется в трансгене otIs305 для отслеживания hsp-16.2prom::che-1.
   1. Держите штамм BAT28 на уровне 15 градусов по Цельсию во все времена, чтобы предотвратить заранеееговую активацию hsp-16.2prom::che-1 transgene. Уменьшите воздействие температуры выше 15 градусов по Цельсию при обработке штамма как можно больше.
5. Для возрастной синхронизации червей используйте метод отбеливания.
   1. Смойте 6-сантиметровые пластины NGM-Agar, содержащие взрослые и яйца BAT28, используя буфер 900 йл M9. Пеллет червей центрифугирование на 900 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант.
   2. Добавьте 0,5 - 1 мл раствора отбеливания и встряхните трубку в течение примерно 1 мин, пока взрослые черви не начнут распахнуться. Монитор с помощью стандартного стереомикроскопа.
   3. Пеллет червей центрифугирование на 900 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант.
   4. Вымойте гранулы червя 3 раза, добавив 800 йл буфера M9 и центрифугирования на 900 х г.
   5. Поместите очищенные яйца на свежие NGM-пластины, посеянные с бактериями OP50. Выращиваем обесцвеченную популяцию бактерий OP50 при 15 градусах Цельсия, пока не достигнут стадии L4 (примерно 4 дня). Личинки L4 могут быть распознааны белым пятном примерно на полпути вдоль брюшной стороны червя с помощью стандартного стереомикроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения зародышевой клетки к фенотипу преобразования нейронов при истощении лин-53,она должна быть истощена в родительском поколении (P0). Скоринг для преобразования фенотипа осуществляется в следующем поколении (семейное поколение F1). Для достижения истощения лин-53 уже в P0, L4 животных подвергаются РНК.
6. Вручную перенесите 50 червей стадии L4 на репликацию с помощью платиновой проволоки на пластину NGM, которая не содержит бактерий и позволяет червям отойти от любых переданных бактерий OP50. Пусть черви двигаться по тарелке около 5 минут. Используйте бактерии из NGM-Agar РНК пластин, ранее посеянных с бактериями лин-53 РНК (или пустой вектор управления) для передачи в соответствующие пластины РНК.
   1. Избегайте передачи бактерий OP50 на фактические пластины РНК. Работа быстро, чтобы свести к минимуму время воздействия штамма до температуры выше 15 градусов по Цельсию.
7. Инкубировать червей на NGM-Agar РНК пластин при 15 градусов по Цельсию в течение примерно 7 дней, пока F1 потомство червей достигает L3 - L4 стадии. Они могут быть четко отделены от P0 животных, поскольку они больше и толще, чем потомство F1.
   1. Визуально проверьте под стандартным стереомикроскопом ли F1 потомство червей показать выступающие вульвы (pvul) фенотип, как показано на рисунке 1. РНК против лин-53 имеет плейотропные эффекты и вызывает фенотип pvul, который может быть использован для оценки того, РНК против лин-53 был успешным.
      ПРИМЕЧАНИЕ:  РНК против лин-53 также может привести к летальности эмбрионов F1. Этот эффект увеличивается, если пластины подвергаются воздействию более высоких градусов, чем 15 градусов по Цельсию, прежде чем животные достигли стадии L3 - L4. Мертвые эмбрионы могут быть признаны путем арестованного развития и отсутствия штриховки.
   2. Инкубационые пластины в темноте, так как IPTG светочувствительный.

Representative Results

Рисунок 1: Фенотип Pvul, вызванный РНК против лин-53. (Вверху) DIC картина L4/молодой взрослый этап F1 потомство червей, полученных из контроля или лин-53 РНК лечение матерей. Шкала баров 20 мкм. (Внизу) животных, обработанных лин-53 РНК дисплей выступающие вульвы (pvul) фенотип (черные стрелки-головы). Фенотип pvul подтверждает, что РНК против лин-53 был успешным. Масштаб баров 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654