Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

קווי תאים משמשים לעתים קרובות בניסויים ביו-רפואיים, שכן הם מאפשרים תרבות מהירה והתרחבות של סוגי תאים לניתוח ניסיוני. קווי התאים מתורבתים בתנאים דומים בהשוואה לתאים מבודדים טריים, או ראשוניים, אך עם כמה הבדלים חשובים בסיסיים: (i) קווי תאים דורשים קוקטיילים של גורם גדילה ספציפי משלהם ו- (ii) הצמיחה שלהם חייבת להיות מנוטרת באופן הדוק יותר מאשר תאים ראשוניים, שכן המוטציות המאפשרות להם לגדול ללא הגבלת זמן גם יכולות להוביל במהירות לצמיחתם. לכן, כאשר קו תא מגיע לנקודת הצמיחה בתרבות שבה הוא מכסה את רוב החלק התחתון של מיכל התרבות, או על 90% השפעה, התאים חייבים להיות resuspended, שטף, בשימוש ניסיוני, קפוא לשימוש מאוחר יותר, או מחדש זרע להתרחבות נוספת במיכלי תרבות חדשים.

וידאו זה ידגים כיצד להשתמש במדדי מדיה כדי לקבוע את תקינות תרבית התא, אשר ריאגנטים וציוד שימושיים להסרת קווי תאים דבקים מתרבות, ושיטות שונות להעברת תאים אלה המתרחבים בחוזקה לתרבויות חדשות יידונו. כמו כן הוכחו שיטות כיצד לתרבות תאים מזינים (חשוב לספק גורמי גדילה חיוניים לקווי תאים) וכיצד להרחיב מספר גדול של תרביות קו התא בבת אחת.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העברת תאים, או תת-תרבות, היא הליך נפוץ שבו תאים מתרבית נתונה מחולקים, או "מפוצלים", לתרבויות חדשות וניזונים ממדיה טרייה כדי להקל על התרחבות נוספת. בעוד הרעיון עצמו הוא פשוט יחסית, בסרטון זה נדון בכמה מהצעדים החשובים יותר לתחזוקה מוצלחת והרחבה של קווי תאים.

מטבוליטים רעילים מצטברים במדיה של תרבית התא לאורך זמן. בעת הרחבת תאים, חשוב במיוחד לשנות את המדיה באופן קבוע כדי לשמור על בריאות התא ולנטר את התרחבות התא כדי למנוע גידול יתר של התא.

בדרך כלל, שני סוגים עיקריים של תאים הם תת-תרבותיים: קווי תאים מונצחים וקווי תאי גזע

קווי תאים מונצחים הם תאים שמקורם באורגניזמים רב-תאיים שחוו סוג כלשהו של מוטציה המשפיעה על ויסות מחזור התאים שלהם, ומאפשרת להם להתרבות ללא הגבלת זמן. אולי קו התא המונצח המפורסם ביותר הוא קו התא HeLa, אשר נגזר נגע סרטן צוואר הרחם נמצא על ביופסיה נלקחה מ הגב 'הנרייטה לאקס בשנת 1951.

בניגוד לקווי התאים המונצחים על ידי סרטן, קווי תאי גזע נוצרים על ידי בידוד תאים מתחדשים עצמית ורב-תכליתיים ממגוון רקמות הן מרקמות בוגרות והן מרקמות עובריות. בתנאים הנכונים התאים האלה, כמו תאי הגזע העובריים האנושיים שאתם רואים כאן, יכולים להישמר בתרבות ללא הגבלת זמן.

תאים הם גם בתרבית אופטימלית בהשעיה, כמו תאים מונצחים מבודדים מדם, או שהם גדלים בצורה הטובה ביותר כאשר דבקים על משטח, כמו במקרה של תאים רבים שמקורם ברקמות.

הצמיחה של תאים דבקים אלה חייב להיות במעקב צמוד כדי להבטיח את בריאות התא. בהתאם לסוג התא, רוב התאים החסידים צריכים להיות מועברים כאשר הם 70-90% confluent, כלומר, כאשר הם מכסים 70-90% משטח מיכל התרבות.

זכור כי קווי התא לשמור על מאפיינים רבים של תרבית התא המקורי, אבל עם כל קטע עוקב הם יכולים גם להתחיל לרכוש מאפיינים ייחודיים לתרבות המורחבת. לכן, שקול להגביל את מספר הפעמים שאתה ממשיך להעביר תרבית תאים בודדת.

בעת העברת תאים, חשוב להשתמש בטכניקה סטרילית ובריגנטים וציוד המתאימים.

זה חיוני כדי להשתמש במדיה המתאימה לצמיחה אופטימלית והרחבה של קו התא שלך. כל קו תא ידרוש קוקטייל תוספת גדילה ספציפי, עם זאת, רוב קווי התא לכל הפחות דורשים תוספי עם הדברים הבאים: סרום, כגון סרום בקר עוברי, אשר חייב להיות מטופל בחום כדי לנטרל את המשלים בקר אשר מספק גורמי גדילה חיוניים עבור התאים, אנטיביוטיקה, כמו פניצילין וסטרפטומיצין, אשר מסייעים להגביל את הצמיחה המזהמת בתרבות, וגורמי גדילה אחרים, כמו גורם גדילה פיברובלסט, כדי לעזור להאריך את הצמיחה וההתרחבות של קווי התא. אחסן את המדיה בתרבית התאים בתוספת, או "מלאה", ב- 4 C כאשר אינך משתמש בה.

ראשית, שים לב לצבע של מדיה תרבית הרקמות. מדיה תרבית תא טרי עשיר בחומרים מזינים ונראה צבע ברור, כתום, בין היתר בשל תוספת של מחוון pH, פנול אדום.

כאשר תאים מתחילים להשתמש בחומרים מזינים בתקשורת, פסולת וחומצה מתחילים להצטבר בתרבית התאים, מורידים את ה- pH. מסיבה זו, מדיה רבים תרבית רקמות מכילים פנול אדום, אשר הופך את התקשורת כתום לצהוב כאשר תאים להפוך את התרבות חומצית. שנה את המדיה לפני שהיא הופכת את הצבע הזה!

כאשר פנול אדום הופך את המדיה צבע ורדרד, המציין כי ה- pH הפך בסיסי מדי עבור צמיחת תאים בריאים, ייתכן שהגיע הזמן לשנות את מיכל הפחמן הדו חמצני שלך, כמו גם את המדיה שלך.

רוב קווי התאים החסידיים מתחברים באופן טבעי לפלסטיק לא מצובש. לכן לוחות תרבית תאי פלסטיק, כמו צלחות פטרי או 6 צלחות היטב, משמשים לעתים קרובות עבור תאים תת-תרבותיים.

בקבוקונים של תרבית תאים מפלסטיק משמשים גם כן. בקבוקון תרבית התא T25, לדוגמה, משמש לעתים קרובות להרחבת אוכלוסיות קו תאים קטנים או כדי להתחיל את הצמיחה של קו תאים המתרחב לאט. צלוחיות תרבית T75 משמשות בדרך כלל עבור קווי תאים המתרבים מהר יותר או כדי ליצור מספר גדול יותר של תאים מאשר יכול להתאים בקבוק T25.

בעת הסרת תאים דבקים, החלבונים הקושרים את התאים לפלסטיק חייבים להיות תחילה מכובסים. לשם כך, טריפסין אנזים העיכול משמש לעתים קרובות. חשוב לתזמן בזהירות את החשיפה טריפסין, כמו טיפול במשך זמן רב מדי יכול לגרום נזק חלבונים אחרים פני התא.

מדיה של תרבית תאים יכולה להכיל מנטרלי טריפסין. לכן, תמיסת מלח חוצצת פוספט, או PBS, משמש לעתים קרובות לשטוף את התאים לפני טריפסיניזציה.

EDTA, כלטור סידן, משמש לפעמים גם כדי לשפר את התפקוד הפרוטאוליטי של טריפסין.

להרחבת מושבת התאים, התאים שזה עתה עברו גדלים באינקובטור תרבית תאים בתנאים המתאימים לקו התא הזה, בדרך כלל בערך 37 מעלות צלזן, 5% CO2 ו-95% לחות.

לפני שתתחיל, חשוב להבין באיזו תדירות יש לפקח על התאים שלך, אשר יהיה תלוי כמה מהר התאים שלך להתרבות.

כעת, כשהמדיה שלכם בצבע כתום שמח, שימו לב לתנאי התרבות האחרים, כמו האם התרבות מעורפלת או לא - מה שמעיד על זיהום - הגודל והצפיפות של מושבות התאים, והאיכות הכוללת של התאים.

אם התאים הגיעו לכ-90% השפעה, הסירו את מדיית תרבית הרקמות ושטפו את התאים ב-PBS נטול סידן ומגנזיום.

עכשיו להוסיף טריפסין לתאים ולאחר מכן לדגור אותם ב 37 C. לאחר כ 5 דקות, לאשר כי התאים התנתקו, ולאחר מכן להפסיק את הפרוטאוליזה על ידי הוספת מדיה תרבית רקמות טריות.

העבר את השעיית התא לתוך צינור חרוטי לצנטריפוגה. לאחר מכן, לאחר ספינינג את התאים, בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור ו resuspend התאים במדיה טרייה. ספר כמה תאים אספת ולאחר מכן זרע את התאים בהתאם לצפיפות המתאימה להרחבה מיידית או מאוחרת יותר.

עכשיו שאתם יודעים איך להעביר תאים, בואו נסתכל על כמה יישומים שונים של השיטה.

כפי שהוזכר קודם לכן, תאי גזע עובריים אנושיים הם סוג של תא שיש לעבור. הם בדרך כלל cocultured עם פיברובלסטים עובריים עכבר, או MEFs, המספקים גורמים המסייעים לתאי גזע לשמור על מצבם pluripotent.

מושבות תאי גזע הגדלות בתאי מאכילים צריכות להיות "נבחרות" ברגע שהן מגיעות לשלב ההתפתחות הנכון. הם יכולים להיבחר על ידי micropipette או על ידי גירוד עדין עם כלי קטיף זכוכית ולאחר מכן מצופה בתרבות חדשה להתרחבות.

קווי תאים מסוימים רגישים לעיכול אנזימטי או שהם כל כך דבקים שהם לא יכולים להיות resuspended עם טיפול טריפסין לבד. מגרד תאים יכול לשמש כדי להסיר בעדינות את התאים מתחתית צלחת התרבות. אם התאים דבקים במיוחד, נסה להזיז פיפטה סרולוגית בתנועת גירוד יציבה תוך שטיפה של תחתית מיכל התא עם מדיה או פתרון מתאים אחר. שמור על שיטה זו, כמו תאים עדינים יכול להיפגע על ידי שיטה מכנית זו של ניתוק.

כדי להגדיל במהירות רבה יותר ובשחזור את התרחבות התאים שלך מאשר ניתן להשיג צלוחיות שכבה אחת, בקבוקונים multilayer, אשר יכול להרחיב תרביות תאים 3-5 לקפל לעומת צלוחיות שכבה אחת, ניתן להשתמש.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לתאים חולפים. בסרטון זה סקרנו מהו קו תא, כיצד לתת-תרבות אחד, וכמה יישומים שונים של תאים עוברים. תודה שצפיתם וזכרו לשמור על המדיה שלכם רעננה!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter