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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

세포주들은 실험 분석을 위해 세포 유형의 급속한 배양과 확장을 허용하기 때문에 생물 의학 실험에서 자주 사용됩니다. 세포주는 새로 고립된, 또는 1차 세포에 비교될 때 유사한 조건하에서 배양됩니다, 또는 1 차적인, 세포, 그러나 몇몇 기본적인 중요한 다름으로: (i) 세포주는 그들의 자신의 특정 성장 인자 칵테일을 요구하고 (ii) 그들의 성장은 1 차 세포 보다는 더 밀접하게 감시되어야 합니다, 그(것)들을 무기한으로 성장할 수 있는 돌연변이는 또한 빨리 그들의 과성장으로 이끌어 낼 수 있기 때문에. 따라서, 세포선이 배양 용기의 바닥 대부분을 커버하는 배양문화의 성장 지점에 도달하면, 또는 약 90% 수렴성,세포는 재장전, 세척, 실험적으로 사용, 나중에 사용하기 위해 동결, 또는 새로운 배양 용기의 추가 확장을 위해 재시드되어야 한다.

본 비디오는 미디어 지표를 사용하여 세포 배양 건강을 결정하는 방법을 시연할 것이며, 시약 및 장비는 배양으로부터 부착 된 세포줄을 안전하게 제거하는 데 유용하며, 이러한 견고하게 확장되는 세포를 새로운 배양으로 옮기는 다양한 방법에 대해 논의 할 것입니다. 또한 피더 세포를 배양하는 방법 (세포주에 필수적인 성장 인자를 제공하는 데 중요한) 및 많은 수의 세포주 배양을 한 번에 확장하는 방법에 대한 방법이 입증되었습니다.

Procedure

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세포의 패스로이징, 또는 세분화는 주어진 배양에서 세포가 새로운 배양으로 분할되고 추가 확장을 용이하게하기 위해 신선한 배지로 공급되는 일반적인 절차입니다. 개념 자체는 비교적 간단하지만,이 비디오에서 우리는 세포주의 성공적인 유지 보수 및 확장을위한 더 중요한 단계 중 일부를 논의 할 것입니다.

독성 대사 산물은 시간이 지남에 따라 세포 배양 매체에 축적. 세포를 확장할 때, 세포 건강을 유지하고 세포 확장을 감시하기 위하여 미디어를 정기적으로 바꾸는 것이 특히 중요합니다.

일반적으로, 세포의 두 가지 주요 유형은 하위 배양: 불멸의 세포주 및 줄기 세포주

불멸의 세포주는 세포 주기 조절에 영향을 미치는 돌연변이의 어떤 모형을 경험한 다세포 유기체에서 파생된 세포입니다, 그(것)들을 무기한 증식하는 것을 허용합니다. 아마도 가장 유명한 불멸의 세포주는 1951년에 헨리에타 부족 씨에게서 취한 생검에서 찾아낸 자궁 경관암 병변에서 파생된 HeLa 세포주입니다.

암에 의해 불멸한 세포주와는 대조적으로, 줄기 세포선은 성인 과 배아 조직 둘 다에서 조직의 다양한 에서 자기 갱신 및 다능성 세포를 격리해서 생성됩니다. 올바른 조건하에서 이 세포는 여기에서 보는 인간 배아 줄기 세포같이, 문화권에서 무기한으로 유지될 수 있다.

세포는 혈액에서 분리된 불멸의 세포와 같이 현탁액에서 최적으로 배양되거나, 많은 조직 유래 세포의 경우와 마찬가지로 표면에 부착될 때 가장 잘 자랍니다.

이 부착 세포의 성장은 세포 건강을 보장하기 위해 밀접하게 모니터링해야합니다. 세포 유형에 따라 대부분의 부착 세포는 70-90% 컨런트, 즉 배양 용기 표면의 70-90%를 커버할 때 통과되어야 합니다.

세포주는 원래 세포 배양의 많은 특성을 유지하지만, 각 연속 통로와 함께 그들은 또한 확장 된 배양에 고유 한 특성을 취득하기 시작할 수 있습니다 명심하십시오. 따라서 개별 세포 배양을 계속 통과하는 횟수를 제한하는 것이 좋습니다.

세포를 통과할 때, 멸균 기술과 적절한 시약 및 장비를 사용하는 것이 중요합니다.

세포주의 최적의 성장과 확장을 위해 적절한 미디어를 사용하는 것이 필수적입니다. 각 세포줄은 특정 성장 보충 칵테일을 필요로 하지만, 적어도 대부분의 세포주 다음과 보충을 필요로: 혈청, 태아 소 혈청 등, 소 보완을 활성화 하기 위해 열 처리 해야 하 고 세포에 대 한 중요 한 성장 인자를 제공 하는, 항생제, 페니실린과 연쇄 절제술 같은, 배양에 있는 성장을 오염 하는 데 도움이 섬유아세포 성장 인자와 같은 다른 성장 인자는 세포선의 성장과 확장을 연장하는 데 도움을 줍니다. 보충 된 저장, 또는 "완전" 세포 배양 매체 4 C 에 그것을 사용 하지 않을 때.

먼저, 조직 배양 매체의 색을 주의하십시오. 신선한 세포 배양 매체는 영양소가 풍부하고 pH 표시기, 페놀 레드의 첨가로 인해 투명하고 주황색으로 나타납니다.

세포가 매체에 있는 양분을 사용하기 시작하면, 폐기물과 산은 pH를 낮추는 세포 배양에서 쌓기 시작합니다. 이러한 이유로, 많은 조직 배양 매체는 세포가 산성 배양을 돌 때 오렌지에서 노란색으로 미디어를 회전 페놀 빨간색을 포함합니다. 이 색상을 설정하기 전에 미디어를 변경!

페놀 레드가 미디어를 분홍빛 색으로 바꿔 pH가 건강한 세포 성장을 위해 너무 기본적이라는 것을 나타내는 경우, CO2 탱크와 미디어를 교체할 때가 될 수 있습니다.

대부분의 부착 된 세포주 코팅되지 않은 플라스틱에 자연적으로 부착됩니다. 따라서 페트리 접시 나 6 개의 우물 플레이트와 같은 플라스틱 세포 배양 판은 세포 분과에 자주 사용됩니다.

플라스틱 세포 배양 플라스크도 사용됩니다. T25 세포 배양 플라스크는 예를 들어, 종종 작은 세포주 인구를 확장하거나 천천히 팽창하는 세포주의 성장을 시작하는 데 사용됩니다. T75 배양 플라스크는 일반적으로 T25 플라스크에 들어갈 수 있는 것보다 더 빨리 증식하거나 더 많은 수의 세포를 생성하는 세포주에게 사용됩니다.

응신 세포를 제거할 때 세포를 플라스틱에 묶는 단백질은 먼저 갈라져야 합니다. 이를 위해 소화 효소 트립신이 자주 사용됩니다. 너무 오래 치료하면 다른 세포 표면 단백질에 손상을 초래할 수 있으므로 트립신 노출시간을 신중하게 하는 것이 중요합니다.

세포 배양 배지는 트립신 중화제를 포함할 수 있다. 따라서 인산염 완충식식염또는 PBS는 트립시화 전에 세포를 세척하는 데 자주 사용됩니다.

EDTA, 칼슘 첼레이터, 때로는 트립신의 프로테올리스틱 기능을 향상 하는 데 사용 됩니다.

세포 식민지의 확장을 위해, 새로 통과된 세포는 그 세포주, 전형적으로 대략 37 C, 5% CO2 및 95% 습도에서 그 세포주에 적합한 조건하에서 세포 배양 인큐베이터에서 성장합니다.

시작하기 전에 세포가 얼마나 빨리 확산되는지에 따라 세포를 모니터링해야 하는 빈도를 이해하는 것이 중요합니다.

이제 미디어가 행복한 주황색으로 되어 있기 때문에, 문화가 흐린지 여부와 같은 다른 배양 조건을 관찰합니다 - 아마도 오염을 나타내는 - 세포 식민지의 크기와 밀도, 세포의 전반적인 품질.

세포가 약 90%의 합류에 도달하면 조직 배양 매체를 제거하고 칼슘및 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 씻으시면 됩니다.

이제 세포에 트립신을 추가한 다음 37 C에서 배양합니다. 약 5 분 후, 세포가 분리된 것을 확인한 다음 신선한 조직 배양 매체를 추가하여 프로테오리시스를 중지합니다.

세포 현탁액을 원심분리를 위한 원심관으로 옮긴다. 그런 다음 세포를 회전 한 후 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 신선한 매체에서 세포를 다시 중단하십시오. 수집한 셀 수를 계산한 다음 즉시 또는 나중에 확장에 적합한 밀도에 따라 세포를 시드합니다.

이제 세포를 통과하는 방법을 알고 있으므로 메서드의 다른 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

앞에서 언급했듯이, 인간 배아 줄기 세포는 통과되어야 하는 세포의 유형입니다. 그(것)들은 전형적으로 줄기 세포가 그들의 다능한 상태를 유지하는 것을 돕는 요인을 제공하는 마우스 배아 섬유아세포, 또는 MEFs와 교배됩니다.

피더 세포에서 자란 줄기 세포 식민지는 적절한 개발 단계에 도달하면 "선택"해야합니다. 마이크로피펫이나 유리 따기 도구로 부드럽게 긁어내어 선택할 수 있으며, 확장을 위한 새로운 문화권에서 도금될 수 있습니다.

일부 세포주 효소 소화에 민감한 또는 그들은 너무 단단히 준수 그들은 혼자 트립신 치료와 함께 다시 중단 될 수 없습니다. 세포 스크레이퍼는 배양판의 바닥에서 세포를 부드럽게 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 세포가 특히 부착된 경우, 세포 용기의 바닥을 미디어 또는 다른 적절한 용액으로 헹구는 동안 단단한 스크래핑 모션에서 세로지학적 파이펫을 이동해 보십시오. 섬세한 세포가 이 기계적 해리 방법에 의해 손상될 수 있으므로 이 방법을 주의하십시오.

단일 층 플라스크에서 달성 될 수있는 것보다 더 빠르고 재현적으로 확장하기 위해, 단층 플라스크에 비해 세포 배양을 3-5 배 확장 할 수있는 다층 플라스크가 사용될 수 있습니다.

당신은 단지 통과 세포에 JoVE의 소개를 보았다. 이 비디오에서 우리는 세포주가 무엇인지, 배양 하는 방법, 그리고 패세이징 세포의 몇 가지 다른 응용 프로그램을 검토. 시청 주셔서 감사하고 신선한 미디어를 유지하기 위해 기억!

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