6,796 Views
•
08:10 min
•
March 21, 2019
DOI:
Transcript
Automatically generated
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الهامة في مجال القلب والأوعية الدموية حول تأثير المصفوفة خارج الخلية خلال المراحل الفسيولوجية والتنموية المختلفة للقلب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل مقارن بين مصفوفات خارج الخلية للجنين والبالغين من خلال تطبيق طريقة مماثلة للفك الخلوي على كلا النوعين من الأنسجة. لذلك كانت هذه الطريقة ناجحة تطبيقها على أجهزة أخرى مثل استئصالات جراحية من مرضى السرطان مما يسهل دراسة المصفوفة خارج الخلية في سياقات مختلفة.
تبدأ من خلال الشطف لفترة وجيزة قلوب الماوس الجنين والكبار مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ثم ضع الأنسجة تحت مجهر تشريح واستخدام مقص صغير مستقيم لإزالة الأذين ، البطين الأيمن ، وsa من قلوب الماوس الكبار. نقل البطين الأيسر إلى طبق بيتري جديد وتقسيم الجدار الأيسر خالية من البطين إلى شرائط طولية سميكة اثنين ملليمتر.
استخدام الماوس الكبار البطين الأيسر explantle من حجم متجانس أمر ضروري لكفاءة إزالة الخلية متسقة. استخدام مشرط وملاقط مسننة مع طرف منحني لإزالة العضلات الحليمة قبل استخدام اثنين من اثنين من ملليمتر الشبكة لمزيد من الشرائط المفروم إلى أجزاء أصغر الأنسجة. عندما تم مفر من جميع الأنسجة، شطف لفترة وجيزة القطع مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتغطية explants.
ونقل قلوب الجنين وقطع من أنسجة القلب الكبار إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر microcentuge تحتوي على 250 ميكرولترات من درجة حرارة القطع الأمثل أو مركب أكتوبر لكل أنبوب. ثم، تجميد عينات أنسجة القلب في الجليد الجاف تبريد إيسوبنتين لتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. لفك الخلايا الأنسجة المحفوظة بالتبريد وضع العينات المجمدة في طبق بيتري تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية تماما explants.
بعد أن ذاب أكتوبر، غمر العينات في طبق بيتري جديد من برنامج تلفزيوني وغسل العينات ثلاث مرات على شاكر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 60 دورة في الدقيقة في كل غسل. بعد الغسيل الأخير، إضافة ملليلتر واحد من العمل العازلة الهابتة إلى كل بئر من العقيمة 24-جيدا لوحة الأنسجة ثقافة واستخدام الملباب غرامة لنقل جزء واحد إلى كل بئر. احتضان لوحة في 25 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، في 165 دورة في الدقيقة تليها ثلاثة يغسل ساعة واحدة في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر، في غسل.
بعد الغسيل الأخير، أضف ملليلتر واحد من سلفات دوديسيل الصوديوم الطازجة أو محلول SDS لكل بئر لاحتضان لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. في اليوم التالي، شطف العينات مع ثلاث غسل 20 دقيقة في ملليلتر واحد من عازلة غسل تحت ضغط الدم لكل غسل تليها إضافة ملليلتر واحد من العلاج DNase حل لكل بئر لمدة ثلاث ساعات الحضانة، في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، يجب أن تفقد العينات التي تم إزالة الخلايا من خلاياها اتساقها الشبيه بالجيلاتين.
ثم غسل شظايا الأنسجة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة لكل غسل تليها غسل بين عشية وضحاها في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد في البئر في درجة حرارة الغرفة و 60 دورة في الدقيقة. لتقييم إزالة بقايا الخلايا من الأنسجة منزوعة الخلايا، في صباح اليوم التالي إصلاح العينات في ملليلتر واحدة من جديد أعد 10٪ صيغة عازلة محايدة تكملة مع 0.03٪ من يوسين مائي في بئر لمدة 2.5 إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، وغسل العينات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر.
واستخدام قالب عينة الفينيل المتاح لتغليف شظايا decellularized في هلام معالجة الأنسجة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بعد ذلك، نقل الأجزاء المغلفة إلى خزعة معالجة تضمين كاسيت. وعملية العينات لالبارافين تضمين من خلال حضانات متتالية لمدة 30 دقيقة في تركيزات تصاعدية من الإيثانول، محلول الهيدروكربون الأليفاتيك الأليفاتيك متساوي الوباليك واثنين من 56 درجة مئوية البرافين يظهر.
بعد البارافين الناشئة الثانية، قم بتركيب عينات في كتلة البارافين واستخدام ميكروتوم للحصول على ثلاثة ميكرومتر سميكة المقاطع. ثم تحقق من كفاءة إزالة الخلايا عن طريق تلطيخ المقاطع مع البقع ثلاثية الألوان haematoxylin وeosin وماسون وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد غسل برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها مع اهتزاز، إضافة 500 ميكرولترات من DPBS أعدت حديثا، تستكمل مع 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من أمفوتريسين B 1٪ محلول المضادات الحيوية لكل سقالة.
وتخزين العينات لمدة يوم إلى سبعة أيام في أربع درجات مئوية. قبل الجلوس في الخلايا، استبدال حل DPBS مع 500 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية الخلية تكملها المضادات الحيوية. واحتضان السقالات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، استخدم المجهر لإضافة أربعة قطرات ميكرولتر من DPBS إلى مركز بئر واحد من 96-جيدا لوحة لكل سقالة. واستخدام ملاقط مستقيمة رقيقة لنقل سقالة واحدة decellularized إلى الجزء العلوي من كل قطرة. قم بإزالة أي DPBS إضافية عن طريق الطموح وتأكد من أن السقالة غير مطوية أو مجعدة.
عندما جفت السقالات على الحواف، ببطء مقعد تعليق خلية واحدة من الخلايا ذات الاهتمام على الجزء العلوي من كل سقالة. تتميز الأنسجة المزيلة الخلايا الجنينية 18 بهيكل شفاف للغاية بينما تظهر الإكراميات البالغة مظهرًا شفافًا إلى اللون الأبيض. هيماتيوكسيلين وosin وماسون trichome البقع تأكيد إزالة الخلايا كفاءة من خلال وجود شبكة مسامية.
يتم تخفيض المواد النووية بنسبة 99.8٪ تقريبًا بعد إزالة الخلايا ، مقارنة بالأنسجة غير المتلاعب بها والتي تعد ضرورية لتجنب إثارة استجابة التهابية غير مرغوب فيها عند الزرع. يمكن رصد قابلية الخلية للحياة داخل السقالات الجالسة أثناء الثقافة في المختبر عن طريق تلطيخ الكالسين. يمكن أيضا إجراء تحليل المحطة الطرفية لإعادة تكدس الخلايا وتوزيعها عبر السقالات ، بعد معالجة البارافين كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية لقسم bioscaffold المركزي.
لذلك مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في استكشاف الخصائص النشطة بيولوجيا من مصفوفة خارج الخلية من قلوب الماوس الجنين والكبار ولكن أيضا من الأنسجة الأخرى.
Summary
Automatically generated
المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.
Read Article
Cite this Article
Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).
Copy