Biology
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इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण
Chapters
Summary October 19th, 2018
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दो तरीके आंतों बाधा समारोह का निर्धारण करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. एक उपकला मीटर (वाल्ट/ओम) सीधे टिशू कल्चर कुओं में कल्चरल epithelia के transepithelial विद्युत प्रतिरोध की माप के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों में, FITC-dextran gavage विधि vivo मेंआंतों पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Transcript
इस प्रयोग का समग्र लक्ष्य विट्रो और वीवो में आंतों के एपिथेलियल सेल पारगम्यता को मापकर एपिथेलियल बैरियर डिसफंक्शन के कारण होने वाली बीमारियों का अध्ययन करना है। यह विधि आंतों के बाधा समारोह क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि भड़काऊ आंत्र रोग से संबंधित। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि आंतों की एपिथेलियल सेल पारमेबिलिटी का आकलन विट्रो और वीवो दोनों में किया जा सकता है।
इस तकनीक के निहितार्थ चिकित्सा या गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों के निदान की ओर फैली हुई है, क्योंकि आंतों के एपिथेलियल बैरियर दोष उन बीमारियों में योगदान देता है। हालांकि यह विधि आंतों के बाधा समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि दवा विषाक्तता अध्ययन और अन्य सेल प्रकारों की बाधा अखंडता। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ कदम सीखना मुश्किल है।
इस विधि का सटीक संचालन अब पाठ्य विवरण से समझा जा सकता है। शुरू करने के लिए, मध्यम के साथ एक T75 फ्लास्क में Caco-2bbe कोशिकाओं को विकसित करें। सेल घनत्व के आधार पर फ्लैक्स को नियमित रूप से खिलाएं।
जब कोशिकाएं 80% कॉन्फ्ल्यूरेंट हों, तो मीडियम को हटा दें और उन्हें कुल्ला करने के लिए कैल्शियम के बिना बाँझ पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर का उपयोग करें। ट्रिप्पसिन-ईडीटीए के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे फ्लास्क को रॉक करें। इसके बाद इसे बिना कमाल के 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
जबकि कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज किया जाता है, 24 अच्छी प्लेटों में असुरक्षित पॉली कार्बोनेट झिल्ली युक्त सम्मिलित आवेषण रखें। फिर बेसल कक्ष में संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें जो झिल्ली की निचली जगह है। फ्लास्क में मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और संस्कृति को ढीले व्यक्तिगत कोशिकाओं, या दो से तीन सेल झुरमुटों में अलग करने के लिए फ्लास्क के अंदर 5 से 10 बार के खिलाफ कोशिकाओं को सख्ती से पिपेट करें।
प्लेट 0.166 कोशिकाओं की मिलीलीटर एपिकल कक्ष में जो झिल्ली का ऊपरी स्थान है। फिर तीन सप्ताह तक के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें । कोशिकाओं को साप्ताहिक रूप से तीन बार खिलाएं, एक दबाव पंप का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के बेसल डिब्बे से माध्यम को ध्यान से आकांक्षी करें।
फिर धीरे-धीरे प्रत्येक डालने के एपिकल कक्ष में माध्यम के एक मिलीलीटर को ड्रिप करें। साइटोकिन अध्ययनों के लिए, ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध या टीईआर माप से एक दिन पहले, बेसल माध्यम को मध्यम से प्रति मिलीलीटर इंटरफेरॉन गामा के 10 नैनोग्राम युक्त बदल देते हैं। प्रयोग के दिन, टीएनएफ के मिलीलीटर प्रति 2.5 या 7.5 नैनोग्राम वाले एचबीएसएस के साथ माध्यम को प्रति मिलाकर बदलें।
मीटर को सही करने के लिए, इनपुट पोर्ट में सुधार इलेक्ट्रोड डालें और ओम मोड चुनें। फिर आर समायोजन पेंच को समायोजित करने के लिए एक पेचकश का उपयोग करें जब तक मीटर 1, 000 ओम की रीडिंग प्रदर्शित नहीं करता है। इलेक्ट्रोड को 15 से 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में स्टरलाइज करें और उन्हें 15 सेकंड के लिए सूखने दें।
इसके बाद प्रायोगिक कोशिका संस्कृति माध्यम में इलेक्ट्रोड कुल्ला करें। इसके बाद, शक्ति चालू करें और ओम मोड चुनें। इलेक्ट्रोड को ऊर्ध्वाधर रखते समय, इलेक्ट्रोड पुलों के लंबे सिरों को बेसल कक्ष में सावधानी से रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे पकवान को छूते हैं।
फिर छोटे सिरों को एपिकल कक्ष में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे माध्यम की सतह से नीचे रहें, लेकिन ऊतक संस्कृति आवेषण से ऊपर रहें। साइटोकिन उपचार के बाद 0, 1, 2, 3 और 4 घंटे में नमूने और खाली आवेषण के प्रतिरोध को मापें। फिर प्रतिरोध रिकॉर्ड करें।
विभिन्न प्लेट प्रारूपों में स्थिरता प्राप्त करने के लिए, प्रतिरोध के उत्पाद और प्रभावी झिल्ली क्षेत्र की गणना करें जैसा कि यहां दिखाया गया है। 24 अच्छी तरह से आवेषण के लिए, प्रभावी झिल्ली क्षेत्र 0.33 वर्ग सेंटीमीटर है। कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, प्रति मात्रा 3.5% वजन की अंतिम एकाग्रता के लिए स्वचालित पानी में डीएसएस जोड़ें।
फिर डीएसएस समाधान का उपयोग करने के लिए 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57 काले छह चूहों के पिंजरों में पीने के पानी की जगह कुल सात दिनों के लिए । चूहों को नियंत्रित करने के लिए डीएसएस के बिना नियमित पेयजल दें। सात दिन के बाद, डीएसएस पानी को नियमित पेयजल में बदल दें।
प्रत्येक दिन, चूहों का वजन करें और चार मापदंडों द्वारा रोग की गंभीरता के अनुसार परिभाषित नैदानिक स्कोर का आकलन करें: गुदा प्रोलैप्स, मल स्थिरता, रक्तस्राव और गतिविधि। अंतिम नैदानिक स्कोर के लिए इन मापदंडों से स्कोर का योग करें। कोलन ऊतकों की हिस्टोपैथोलॉजिकल स्थिति का विश्लेषण करने के लिए सात दिन DSS उपचार के बाद, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु के बाद, पेट और सीकम को अलग करें, और पेट की लंबाई को मापें।
डिस्टल कोलन से 0.5 सेंटीमीटर सेगमेंट काटें, और ऊतक को 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में ठीक करें जिसमें रात भर 10% फॉर्मेलइन के 10 मिलीलीटर होते हैं। ग्रेडेड इथेनॉल और जाइलीन के साथ तय ऊतकों को धोएं। फिर पैरफिन में ऊतकों को एम्बेड करें और हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग के लिए छह मिलीमीटर सेक्शन काटें।
डीएसएस-प्रेरित चूहों में एपिथेलियल बैरियर पारमशीलता को मापने के लिए, डीएसएस प्रशासन की शुरुआत के सात दिन बाद, चूहों को तीन घंटे तक उपवास करें। बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए एक गैवर सुई को ऑटोक्लेव करें, फिर चूहों को ग्रैव करने के लिए बाँझ पानी में 80 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर चार किलोडलटन फिटसी डेक्सट्रान के 150 माइक्रोलीटर का उपयोग करें, और सीरम संग्रह के बाद मानक वक्र को मापने के लिए अप्रयुक्त फिटसी डेक्सट्रान रखें। इसके बाद, पारमी गणना के लिए चूहों का वजन करें।
चार घंटे बाद, आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करने के बाद, सजगता और मूंछ आंदोलन की कमी से उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। फिर चूहों को पांच मिनट के लिए हीट ब्लॉक पर रखें। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, पूंछ का एक सेंटीमीटर टुकड़ा क्लिप और एक सीरम संग्रह ट्यूब में पूंछ से रक्त के १०० माइक्रोलीटर इकट्ठा ।
एकत्र किए गए रक्त को दस मिनट के लिए 10, 000 बार जी और कमरे के तापमान पर स्पिन करें। पानी के साथ सीरम को एक से चार तक पतला करें। फिर, एक मानक वक्र बनाने के लिए, अप्रयुक्त फिटसी डेक्सट्रान के कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए पानी का उपयोग करें।
सीरम के प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और मानक वक्र नमूनों को 96 अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ें। एक प्लेट रीडर का उपयोग करके, 485 की उत्तेजन और 528 के उत्सर्जन पर फ्लोरेसेंस पढ़ें। मानक वक्र के आधार पर पारमशीलता मूल्यों की गणना करें, और कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए चार से गुणा करें।
मूल्यों को सामान्य करने के लिए वजन से फिटसी डेक्सट्रान की एकाग्रता को विभाजित करें। यह यदि चूहों बीमार हैं, और वजन कम कर दिया है तो फिटसी डेक्सट्रान डिलीवरी में अंतर को सामान्य करने में मदद करता है। यहां दिखाए गए कैको-2bbe कोशिकाओं को अविभेदित और विभेदित कोशिकाओं के बीच अंतर दिखाने के लिए नाभिक और एफ-ऐक्टिन दाग के साथ लेबल किया गया था ।
तनाव फाइबर अविभेदित कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से देखा जाता है। विभेदित कोशिकाओं में एक छोटी मात्रा, बड़ा नाभिक, और अविभेदित कोशिकाओं की तुलना में कम तनाव फाइबर होते हैं। टीएनएफ एमएलएसके-निर्भर टाइट जंक्शन विनियमन के माध्यम से आंतों के बाधा नुकसान के लिए केंद्रीय है।
जैसा कि इस आंकड़े में देखा गया है, टीएनएफ खुराक-निर्भर तरीके से कैको-2बीबी मोनोलेयर के टीआर को काफी कम कर देता है, यह सुझाव देता है कि टीएनएफ एपिथेलियल पारफली बढ़ाता है। उनके प्रारंभिक शरीर के वजन की तुलना में, डीएसएस के साथ इलाज किए गए चूहों का वजन काफी कम हो जाता है। कोलाइटिस की गंभीरता गुदा प्रोलैप्स, मल स्थिरता, रक्तस्राव और गतिविधि द्वारा अर्जित की जाती है।
हेमाटॉक्सीलिन और ियोसिन के साथ दाग वाले कोलोनिक ऊतकों के क्रॉस-सेक्शन डीएसएस-इलाज चूहों में कोलोनिक म्यूकोसल क्षति दिखाते हैं। इसके अलावा, कोलन तहखाने की लंबाई, साथ ही पेट, डीएसएस-इलाज चूहों में कम हो जाती है। अंत में, चूहों को नियंत्रित करने की तुलना में डीएसएस-इलाज चूहों में फिटसी डेक्सट्रान स्टेनिंग के स्तर में लगभग दो गुना वृद्धि हुई है।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, परिचालन प्रक्रियाओं को मानकीकृत करके और सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करके त्रुटि को कम करना याद रखना महत्वपूर्ण है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने मॉडल जीवों और सेल लाइनों दोनों में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों का पता लगाने के लिए आंतों के बाधा समारोह के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त किया। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि टीईआर को मापकर आंतों की एपिथेलियल पारगम्यता का निर्धारण कैसे किया जाए, फिटसी डेक्सट्रान को देखा जाए और रूपात्मक और हिस्टोकेमिकल परिवर्तन ों को देख रहे हैं।
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