Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sensoriale, come la nocicezione periferica. Il vantaggio principale di questo tecnico è che indagare il meccanismo cellulare dei neuroni sensoriali con il modello che più simula alle condizioni fisiologiche. Raccogli i gangli della radice dorsale lombare dal tronco di un topo di due o tre settimane.

Inizia facendo due tagli lungo i lati della colonna vertebrale e un taglio laterale per segnare l’estensione rostrale della colonna lombare. Quindi, utilizzare le forcep di taglio osseo per rimuovere i muscoli dorsali della colonna vertebrale. Quindi, rimuovere la porzione dorsale delle vertebre ed esporre il midollo spinale.

Quindi utilizzare forbici di dissezione e forcep per rimuovere il midollo spinale. Identificare il DRG lombare contando le vertebre dall’ultima costola. Questo diagramma mostra le posizioni delle vertebre.

Utilizzare micro forbici per raccogliere il DRG lombare bilaterale 12 da L1 a L6. Rimuovere eventuali fibre neuronali attaccate per migliorare la purezza della coltura. Trasferire ogni DRG lombare in un piatto di coltura di 35 millimetri contenente due millilitri di mezzo privo di siero freddo ghiacciato. Trasferire il piatto da 35 millimetri contenente DRG in una cappa laminare e lavare il DRG con mezzo privo di siero tre volte con pipetta.

Utilizzare pinzette sterili per spostare le DRAG in un nuovo piatto di coltura di 35 millimetri contenente due millilitri di collagenasi sterile di tipo 1A. Posizionare il tessuto nella soluzione di collagenasi nell’incubatrice di coltura tissutale di 37 gradi Celsius per 30 minuti per iniziare la dissociazione delle cellule. Dopo l’incubazione, rimuovere la soluzione di collagenasi e lavare il DRG tre volte in due millilitri della soluzione salina bilanciata di Hank.

Successivamente, aggiungere due millilitri di EDTA di tripsidenza prebellica dello 0,05% al piatto e digerire il DRG nell’incubatore per 30 minuti come prima. Dopo la digestione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire i due millilitri di soluzione contenente DRG in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Il DRG potrebbe attenersi alla pipetta di vetro, quindi questo passaggio deve essere eseguito con cura.

La perdita effettiva può essere evitata mantenendo la soluzione contenente DRG nell’estremità cono della pipetta di vetro e trasferendo la soluzione nel tubo di centrifuga lentamente ma senza pause. Quindi, centrifugare la soluzione a 290 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e aggiungere altri due millilitri di mezzo privo di siero per rimescolare il DRG.

Ripetere il lavaggio due volte, utilizzando due millilitri di mezzo di coltura prebellico per rimospendare il tessuto dopo la centrifugazione finale. Utilizzare la pipetta lucida a fiamma sterile preparata in precedenza per triturare manualmente il DRG circa 60 volte. Successivamente, rimuovere una piastra di 24 pozzetti rivestita in poli-L-lisina contenente un millilitro di mezzo di coltura per pozzo dall’incubatore di CO2.

Aspirare il mezzo di coltura incubato dal piatto. Seminare le cellule DRG da un ratto in quattro dei pozzi. Questo dà una densità di semina di circa 500.000 cellule per pozzo.

Il giorno seguente, sostituire il mezzo di coltura con mezzo integrato con AraC micromolare e 100 nanogrammi per millilitro NGF. Il terzo giorno dopo la placcatura cellulare, cambiare il mezzo a 0,5 millilitri di mezzo senza siero prebellificato e incubare per un’ora. Durante l’incubazione, aggiungere 50 millimolare di siRNA in un microlitro di acqua priva di RNasi a 12,5 microlitri di mezzo privo di siero per trasfezione.

Quindi pipettare 2,5 microlitri di reagente di trasfezione in 10 microlitri di mezzo privo di siero per ogni trasfezione. Mescolare entrambe le soluzioni con pipetta e incubare questa soluzione di trasfezione mista per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, aggiungere la soluzione di trasfezione nei pozzali della piastra da 24 pozzi contenente DRG e mescolare tremando delicatamente.

Dopo un’incubazione di sei ore, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di coltura con 20%FBS, 10 micromolare AraC e 100 nanogrammi per millilitro NGF in ogni pozzo di cellule. Infine, incubare il DRG in un incubatore di CO2 di 37 gradi Celsius per altre 66 ore. Il sesto giorno dopo la placcatura e 72 ore dopo la trasfezione del siRNA, cambiare il mezzo di coltura in 200 microlitri di mezzo privo di siero.

Dopo un’incubazione di 30 minuti, aggiungere un microlitro della sostanza chimica di stimolazione e mescolare delicatamente con la pipettazione. L’agonista NPFFR2, il dNPA e il veicolo corrispondente vengono utilizzati qui. Dopo aver incubato per il periodo richiesto, raccogliere il mezzo di coltura dal piatto di coltura e centrifugare a 5000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali impurità sospese.

Raccogliere il supernatante dalla centrifugazione e diluire con soluzione salina tamponata con fosfato in base alle esigenze. Saggio i livelli di neurotrasmettitori con kit di immunoanalisi enzimatici disponibili in commercio. Il primo giorno, il corpo cellulare di un singolo neurone indicato dalla freccia è stato attaccato sul fondo di un piatto.

È presente anche una cella gliale indicata da una punta di freccia. Le cellule gliali hanno duplicato ed esteso i processi per circondare il corpo cellulare del neurone sensoriale il secondo giorno, un processo che è stato ancora più prominente il terzo giorno. In un’altra cultura, la proteina CGRP è stata macchiata per rivelare la forma dei neuroni.

La colorazione delle proteine CGRP appare nel citoplasma e negli assoni dei neuroni sensoriali. Le morfologie nucleari dei neuroni e delle cellule gliali sono distinte se macchiate con DAPI. I neuroni hanno un nucleo più grande e arrotondato rispetto alle cellule gliali.

In confronto, i nuclei di glial sono di forma più ovale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare e culturare il ganglio della radice dorsale e usarlo come strumento per indagare le funzioni fisiologiche sottostanti.

Non dimenticare che lavorare con le celle primarie può essere molto più difficile che lavorare con le normali linee cellulari ed essere delicati è sempre il modo migliore quando si esegue questa procedura.