Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Спинной корень ганглиев изоляции и основной культуры для изучения нейромедиатора релиз
Chapters
Summary October 6th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Спинной корень ганглиев (DRG) первичных культур часто используются для изучения физиологических функций или события, связанные с патологией в сенсорных нейронов. Здесь мы продемонстрировать использование поясничной DRG культур для обнаружения освобождения нейромедиаторов, после нейропептида FF рецептор типа 2 стимуляции с селективным агонистом.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сенсорных исследований, таких как периферическое ноцицепция. Основным преимуществом этого технического является то, что исследование клеточного механизма сенсорных нейронов с моделью, которая наиболее имитирует физиологическое состояние. Соберите поясничный спинной корень ганглиев из ствола двух-трехнедельной крысы.
Начните с двух разрезов по бокам позвоночника и один боковой разрез, чтобы отметить ростральный размер поясничного отдела позвоночника. Затем используйте костно-резаные миппы для удаления спинных мышц позвоночника. Затем удалите спинную часть позвонков и обнажите спинной мозг.
Затем используйте ножницы и типсы для удаления спинного мозга. Определите поясничный DRG, подсчитав позвонки из последнего ребра. На этой диаграмме показаны положения позвонков.
Используйте микро ножницы для сбора 12 двусторонних поясничных DRG от L1 до L6. Удалите любые прикрепленные нейронные волокна, чтобы улучшить чистоту культуры. Перенесите каждый поясничный DRG на 35-миллиметровое культурное блюдо, содержащее два миллилитра среды, свободной от холодной сыворотки. Перенесите ДРГ-содержащую 35-миллиметровую тарелку в ламинарный капюшон и трижды промойте DRG с помощью безотовилочной среды пипеткой.
Используйте стерильные пинцеты, чтобы переместить DRGs в новое 35-миллиметровое блюдо культуры, содержащее два миллилитров стерильной коллагеназы типа 1A. Поместите ткань в раствор коллагеназы в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы начать диссоциацию клеток. После инкубации удалите раствор коллагеназы и помойте DRG три раза в два миллилитров сбалансированного соленого раствора Хэнка.
Затем добавьте в блюдо два миллилитров предварительно приготовленного 0,05%трипсина ЭДТА и усваиваете DRG в инкубаторе в течение 30 минут, как и раньше. После пищеварения используйте стеклянную пипетку для переноса двух миллилитров раствора, содержащего DRG, в 15-миллилитровую центрифугу. DRG может придерживаться стеклянной пипетки, так что этот шаг должен быть выполнен с осторожностью.
Фактической потери можно избежать, сохраняя DRG-содержащий раствор в конусном конце стеклянной пипетки, и передачи раствора в центрифугу трубку медленно, но без паузы. Далее центрифуга раствора при 290 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования, удалить супернатант и добавить еще два миллилитров сыворотки свободной среды для повторного перерасхода DRG.
Повторите мыть дважды, используя два миллилитров довоенной среды культуры, чтобы повторно использовать ткань после окончательной центрифугации. Используйте ранее подготовленные стерильные пламя полированной пипетки вручную тритурировать DRG примерно 60 раз. Затем удалите из инкубатора CO2 поли-L-лизин покрытием 24 хорошо пластины, содержащие один миллилитр культуры среды на колодец.
Аспирировать инкубированную культурную среду из блюда. Семя DRG клеток от одной крысы в четыре скважины. Это дает плотность посева около 500 000 клеток на колодец.
На следующий день замените культурную среду средой, дополненной 10 микромолярной AraC и 100 нанограммами на миллилитр NGF. На третий день после покрытия клеток, изменить средний до 0,5 миллилитров довоенной сыворотки свободной среды, и инкубировать в течение одного часа. Во время инкубации добавьте 50 миллимолярной siRNA в один микролитр воды без RNase до 12,5 микролитров без сыворотки среды на трансфекцию.
Затем пипетка 2,5 микролитров трансфектного реагента в 10 микролитров безотовичной среды для каждой трансфекции. Смешайте оба раствора пипеткой и инкубировать этот смешанный раствор трансфекции в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут добавьте раствор трансфекции в колодцы пластины, содержащей 24 скважины DRG, и аккуратно перемешайте.
После шестичасовой инкубации добавьте 0,5 миллилитров среды культуры с 20%FBS, 10 микромолярной AraC и 100 нанограмм на миллилитр NGF в каждый колодец клеток. Наконец, инкубировать DRG в 37 градусов по Цельсию CO2 инкубатор в течение еще 66 часов. На шестой день после покрытия и через 72 часа после трансфекции siRNA измените культурную среду до 200 микролитров среды, свободной от сыворотки.
После 30-минутной инкубации добавьте один микролитер химического вещества стимуляции и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Здесь используются агонист NPFFR2, dNPA и соответствующий автомобиль. После инкубации в течение необходимого периода, собирать культуру среды из культуры блюдо, и центрифуга в 5000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы удалить любые приостановленные примеси.
Соберите супернатант из центрифугации и разбавлять фосфатным буфером солевым раствором по мере необходимости. Анализ уровней нейротрансмиттеров с коммерчески доступными наборами ферментного иммуноанализа. В первый день на дно блюда было прикреплено клеточное тело одного нейрона, указанное стрелкой.
Глиальная ячейка, указанная наконечником стрелы, также присутствует. Глиальные клетки дублировали и расширили процессы, чтобы окружить клеточное тело сенсорного нейрона на второй день, процесс, который был еще более заметным на третий день. В другой культуре белок CGRP был окрашен, чтобы выявить форму нейронов.
CGRP окрашивание белка появляется в цитоплазме и аксоны сенсорных нейронов. Ядерные морфологии нейронов и глиальных клеток отличаются, когда окрашены DAPI. Нейроны имеют большее и более округлое ядро, чем глиальные клетки.
Для сравнения, ядра глиальных более овальные по форме. После освоения, этот метод может быть сделано в течение двух с половиной часов, если она выполняется должным образом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как вскрыть и культуры спинного корня ганглиона, и использовать его в качестве инструмента для расследования основных физиологических функций.
Не забывайте, что работа с первичными клетками может быть гораздо сложнее, чем работа с обычными клеточными линиями, и быть нежным всегда лучший способ при выполнении этих процедур.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
