Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In Vivo Två-foton avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss
Chapters
Summary October 18th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar en i vivo två-photon imaging protokoll för imaging hjärnbarken av neonatala möss. Denna metod är lämplig för att analysera utvecklingsmässiga dynamiken i kortikala neuroner, de molekylära mekanismer som styr den neuronala dynamiken, och förändringar i neuronala dynamics i sjukdomsmodeller.
Transcript
Denna metod kan bidra till att svara på viktiga frågor i neurovetenskap, särskilt de som rör neuron socket bildning. Den största fördelen med denna teknik är att forskare kan analysera de morfologiska förändringarna av enskilda nervceller i levande neonatal möss. Börja med en sövd postnatal dag fem valp och fortsätt endast i avsaknad av en reaktion på svansen nypa test.
Först sterilisera hårbotten genom att torka den med 70%etanol. Använd sedan sax steriliserad med 70%etanol för att ta bort cirka 20 kvadratmillimeter av huden som täcker skallen. Därefter använder sterila tlys och en ren bomullspinne indränkt i cortex buffert, för att ta bort fascian i skallen.
Använd en lastspets för att applicera vävnadslim på den indrivna hudytan för att stoppa blödningen samtidigt som du undviker det område som ska avbildas. Placera valpen på en annan värmedyna, inställd på 37 grader Celsius, och låt den återhämta sig från anestesi. Vänta cirka 30 minuter tills vävnadslimmet har torkat och stelnat.
När vävnadslimmet har torkat, börja den kraniella fönsterberedningen på den reesthetized musen. Applicera en droppe cortex buffert på skallen, använd sedan ett sterilt rakblad för att försiktigt öppna en millimeter diameter område av skallen, lämnar dura intakt. Applicera cortex buffert för att hålla hjärnytan fuktig.
Använd en liten bit av gelatin svamp indränkt i cortex buffert för att stoppa blödning. Använd en fräsch bit för att komprimera ena sidan av kraniotomi och dränera någon buffert och blod från hamburgytan utan att vidröra dura. Detta är det mest kritiska steget för att förbereda rensa fönster.
Duran måste vara oskadad och borsten ska avlägsnas från den exponerade duran. Därefter använder en pipett spets för att tillämpa ett tunt lager av en procent låg smältning uppstod, upplöst i cortex buffert. Applicera en rund, tre millimeter glaskåpa glida på agaros gelskiktet.
Ta bort alla bubblor mellan täckslien och agarosgelskiktet genom att hälla i överskott av agarosgel mellan dem. Använd pincett för att avlägsna överskottet gel, utskjutande från under locket slip. Blanda cementpulver och cementvätskan.
Använd en pipettspets för att applicera blandningen på skallen innan den stelnat. Sedan fäster du en skräddarsydd titanstång på hjärnbenet med hjälp av tandcement. Rikta in titanstången, och luckan i parallell för att enkelt fånga bilder.
Täck den exponerade skallen med tandcement. Sedan injicerar subkutant ett smärtstillande medel. Placera valpen i en återhämtningsbur på en 37 grader celsius värmedyna i en timme tills tandcementet har stelnat.
För att börja bildbehandling, först ställa in två-foton laser våglängd. För RFP-excitering, använd en våglängd på 1000 nanometer. Torka av luckans yta med 70%etanol.
Fäst den sövda valpen på titanplattan på bildsteget, med hjälp av titanstången. Använd goniometerstadiet, för att justera huvudet, så att luckan är parallell med objektivet. Underhåll valpens kroppstemperatur under avbildning med hjälp av en värmedyna inställd på 37 grader Celsius och minska isoflurankoncentrationen till 0,7 %till 1 %Placera bildfasen under 20x objektivlinsen i de två fotonmikroskopet.
Applicera en droppe vatten på täcksligen. Ställ in programvaran för att förvärva Z-stack bilder med 1,4 mikron intervall. För skikt fyra neuron imaging, ställ in Z bredd till mellan 150 och 300 mikrometer för att bilden hela dendritiska morfologi.
Använd långsam skanning och genomsnitt för att få tydliga bilder som visar neuronal morfologi. Det tar vanligtvis mer än 20 minuter att förvärva hela dendritiska morfologi. Denna bild visar en representativ Z-stack bild av lagret fyra när nervceller av P5 valp.
Pilen indikerar neuronen som ska analyseras. Nervceller med suddiga dendrites bör tas bort från analysen. Denna bild visar en högre förstoring bild av den angivna neuron i föregående bild.
Blå pilspetsar anger dendritiska tips som kommer att dras tillbaka vid nästa tidspunkt, och de små vita pilspetsarna anger axonen för en granncell. Efter 4,5 timmar dras de dendritiska spetsarna med blå pilspetsar tillbaka, och de dendritiska spetsarna med gula pilspetsar är avlånga. En representativ dendritiska morfologi återuppbyggnad visas här, nervceller visar frånkopplad dendriter som ses här, bör uteslutas från analyser.
Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att hålla dura intakt, under processen. Med hjälp av detta förfarande, andra metoder som i framdrivningen imaging kan utföras för att svara på ytterligare frågor relaterade till neuron aktivitetsmönstret i neonatal hjärnan.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
