Neuroscience
You have full access to this content through Seoul National University of Education
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Sub acute cerebrale Microhemorrhages geïnduceerd door Lipopolysaccharide injectie bij ratten
Summary October 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We presenteren een protocol om te induceren en te detecteren CMHs veroorzaakt door LPS injectie bij Sprague-Dawley ratten, die kan worden gebruikt in de toekomst onderzoek onderzoek naar de pathogenese van CMHs.
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in cerebrale micro-bloeding gebied, zoals de etiologie, distributie, en detectie van cerebrale micro-bloeding en ga zo maar door. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat LPS-injecties stabiel ontstekingen veroorzaken. Bovendien is lps-injectie vrij eenvoudig, zuinig en kosteneffectief.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de inductie van de hersenbloeding, kan het ook worden toegepast op andere hersenaandoeningen zoals depressie, schizofrenie, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en prionziekte. Toletoegeid lps bij een dosis van een milligram per kilogram lichaamsgewicht aan 10 weken oude mannelijke Sprague Dawley ratten door intraperitoneale injectie, dan terug elke rat naar de huiskooi. Herhaal de LPS-injectie na zes uur en 16 uur.
Houd er rekening mee dat het injecteren van SD-ratten met LPS met een dosis van één milligram per kilogram kan leiden tot een sterfte van 5%. De mortaliteit kan verder toenemen bij jongere of oudere ratten of zwangere vrouwelijke ratten. Breng de ratten terug naar hun kooien na de LPS-injectie en geef ad libitum toegang tot eten en drinken.
Onder terminale anesthesie, voer een vijf tot acht millimeter diepe hartpunctie op elke rat. Het punctiepunt moet vijf millimeter naar de linkermarge van het borstbeen liggen op de derde en vierde intercostale ruimte. Houd de naald op zijn plaats en vervang de lege buis door een buis met Evans blauw.
Wacht tot het herstel van het bloed wordt waargenomen, en injecteer vervolgens Evans blauw bij een dosis van 0,2 milliliter per 100 gram lichaamsgewicht in de linker hartventrikel. Houd de rat in een supine positie voor 10 minuten als de beoordeling van Evans blauwe lekkage door de bloed / hersenbarrière door immunofluorescentie beeldvorming. Voer hartperfusies uit met behulp van ijskoude 200 tot 300 milliliter van 0,9% zoutoplossing om de cerebrale vasculatuur en hersenen te wissen.
Schakel over op ijskoud 4%paraformaldehyde voor fixatie. Dan, na het isoleren van de hersenen, dompel het onder in 20% sacharose in PBS voor ten minste zes uur of totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de buis. Verander de oplossing in 30% sacharose en repareer deze nog eens zes uur.
Ten slotte, bereid 10-millimeter dik hersenweefsel secties met behulp van een cryostat. Was de glijbanen met PBS drie keer gedurende vijf minuten per stuk, dan incubeer glijbanen met 4, 6'diamidino-2-phenylindole of DAPI oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van de glijbanen in PBS zoals voorheen, monteer de glijbanen met PBS-glycerol oplossing.
Leg beelden vast op een fluorescentiemicroscoop. EB afzetting wordt aangegeven door rode fluorescentie, kernen worden aangegeven door blauwe fluorescentie. Begin met H&E-vlekken door de glijbanen in gedestilleerd water te wassen.
Vervolgens dompel je gedurende acht minuten onder in hematoxylin-oplossing. Als alternatief, voor Perl Pruisische blauwe vlekken, vlek in reactie oplossing met gelijke delen mengsel van ferrocyanide en zoutzuur gedurende 10 minuten. Na het bevlekken, wassen in stromend leidingwater gedurende vijf minuten.
Onderscheid in 1%zure alcohol gedurende 30 seconden. Na het wassen in stromend leidingwater gedurende een minuut, vlek in 0,2%ammoniak water of verzadigde lithium carbonaat oplossing voor 30 seconden tot een minuut. Vervolgens was je vijf minuten in stromend kraanwater.
Tegenvlek met eosineoplossing gedurende 30 seconden tot één minuut. Dehydrateren door middel van 90%-alcohol, dan 95%-alcohol, en absolute alcohol gedurende 0,5 tot twee minuten per stuk. Na uitdroging, duidelijk in xyleen gedurende 30 seconden.
Na montage, analyseren van de H & E kleuring met behulp van een brightfield fluorescentie microscoop. De rode bloedcellen die vrijkomen uit bloedvaten, die bestanddelen zijn van de CMH's, verschijnen in rood-oranje onder H&E-kleuring. Surface CMH's kunnen worden gedetecteerd door middel van grove observatie, zoals aangegeven door de rode pijlen.
Evans blauwe vlekken onthult zichtbare rode fluorescentie waar Evans blauwe moleculen lekten uit een gewonde bloed-hersenbarrière. H&E vlekken toont rode bloedcellen gevonden buiten de haarvaten, en Pruisische vlekken onthult ferrische ionen punten afgeleid van lyse van rode bloedcellen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de dosis LPS om cerebrale microbloeding te induceren groter is dan die gebruikt bij de ziekte van Parkinson of schizofrenie model.
Daarom moet het milieu van dieren schoon worden gehouden om het sterftecijfer te verminderen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals elektronenmicroscopie, magnetische resonantiebeeldvorming en immunofluorescente beeldvorming worden uitgevoerd om de schade aan de buitenste structuur van de bloed-hersenbarrière bij cerebrale microbloedingen, de verdeling van cerebrale microbloedingen in de hersenen parenchyma in vivo te bepalen, evenals gliacelactivering.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
