Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Denne metoden kan bidra til å løse viktige utfordringer innen kreftimmunterapi ved å legge til rette for utvikling av onkolyktiske vektorer for målrettet immunmodulering. Den største fordelen med det anvendte omvendte genetiske systemet er dens allsidighet;derfor kan vektorer tilpasses for å løse ulike forskningsspørsmål og målrette svulster med ulike immunsignaturer. Virusforplantningstrinnene som spesielt bestemmer det optimale tidspunktet for å høste virus, er vanskelig å lære av en tekstprotokoll fordi syncytia-formasjon må vurderes visuelt over tid.

For å begynne design og klone rekombinant immunmodulerende vektorer som beskrevet i manuskriptet. Denne protokollen beskriver spesifikke trinn for utvikling av en onkolytisk meslingvaksinevektor, koding av en bispesifikk T-celle engasjerer. For å redde meslingvirus fra cDNA, 24 timer før transfection plate meslinger virus produsent celler jevnt på en 6 veggplate.

Seed 200, 000 celler i 2 milliliter DMEM inneholder 10 prosent FBS per brønn for å oppnå 65 til 75 prosent samløpet på tidspunktet for transfection. Bland 5 mikrogram rekombinant DNA-koding av meslingvirusantigenomet som skal brukes til å transfisere cellene. Passende plasmider og en fluorescerende reporter i et totalt volum på 200 mikroliter DMEM.

Tilsett 18,6 mikroliter med liposomal transfeksjonsreagens til blandingen og knips umiddelbart røret for å blande. Inkuber denne transfeksjonsblandingen i 25 minutter ved romtemperatur. For å transfisere MV produsent cellene fjerne mediet fra 6 godt plate vokst til 65 til 75 prosent samløpet og legge til 1,8 milliliter DMEM med 2 prosent FBS og 50 mikrogram per milliliter Kanamycin per brønn.

Tilsett deretter transfection mix dropwise til hver brønn og virvle forsiktig. Inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid. På neste dag erstatte mediet med 2 milliliter frisk DMEM med 2 prosent FBS og 50 mikrogram per milliliter Kanamycin og gjenta dette når mediet blir surt anerkjent av den gule fargen.

Bruk et mikroskop til å observere celler daglig for reportergenuttrykk og syncytia-dannelse. Når store syncytia bestående av 20 eller flere celler er synlige eller når cellene blir for tett høste viruset. 24 timer før den forventede høstfrø ca 1,5 millioner MV produsentceller i 12 milliliter DMEM med 10 prosent FBS på 10 centimeter retter for å oppnå 65 til 75 prosent samløpet på tidspunktet for virus inokulasjon.

For å samle viruset progyny bruk en celle skrape for å forsiktig skrape tilhengerceller fra 6 veggplate med trans infiserte celler. Overfør mediet som inneholder de skrapte cellene til et sentrifugerør. Sentrifuge i minst 2500 ganger G og 4 grader Celsius i 5 minutter for å fjerne celleavfall.

Etter sentrifugering bland den cellefrie supernatanten med serumfritt medium til et endelig volum på 4 milliliter for å forberede inokulum. Fjern mediet fra 10 centimeter parabolen med MV produsentceller og legg inoculum til cellene. Inkuber i minst 2 timer ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid.

Etter inkubasjon legge til 6 milliliter DMEM med 10 prosent FBS og inkubere celler over natten. Deretter erstatte mediet med 12 milliliter fersk DMEM med 10 prosent FBS og inkubere ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid til høsting. Vær oppmerksom på cellene minst to ganger daglig.

Før syncytia briste når membranavbrudd blir synlig høste viruset. For å høste den første passasjen, fjern supernatant fra platen og tilsett 600 mikroliter serumfritt medium. Bruk deretter en celleløfter til å skrape cellene og overføre til et rent rør.

Umiddelbart etter at fryse viruset suspensjon i flytende nitrogen og lagre på 80 grader Celsius i minst 24 timer for å sikre grundig frysing. For å bestemme titers av virus aksjer i octuplicates per aliquot ved hjelp av 96 veggplater. Trekk først produsentcellene fra T75 cellekulturflasker inn i 50 milliliter konisk rør.

Telle cellene og justere celle suspensjon til 150,000 celler per milliliter i DMEM med 10 prosent FBS. Tilsett 90 mikroliter DMEM med 10 prosent FBS per brønn av en 96 veggplate. Deretter legger du til 10 mikroliter fra en aliquot av viruslageret til alle 8 brønner i den første kolonnen på platen.

Bland godt ved å pipetter opp og ned minst 10 ganger. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 10 mikroliter av hver brønn, fra den første til den andre kolonnen, og bland godt ved å pipetter opp og ned. Gjenta dette for hver kolonne for å oppnå serielle tidoblet fortynninger av viruset ved hjelp av friske pipettespisser for hvert fortynningstrinn.

Kast 10 mikroliter fra hver brønn i den siste kolonnen. Legg til 100 mikroliter cellesuspensjon med 150 000 celler per milliliter til hver brønn, og sørg for at det ikke er noen celleklumper. Inkuber ved 37 grader Celsius, 5 prosent karbondioksid i 48 timer.

Se etter syncytia ved hjelp av et lett mikroskop. Telle syncytia i hver brønn av kolonnen med den høyeste fortynningsfaktoren som inneholder synlig syncytia. For virus som koder en fluorescerende reporter, kan syncytia telles ved hjelp av fluorescensmikroskopi.

For analyse av meslinger virus replikering kinetikk en dag før infeksjon frø 100, 000 vero celler i 1 milliliter DMEM med 10 prosent FBS per brønn på 12 veggplater med minst 2 brønner for hver tidspunkt av interesse. For å infisere cellene erstatte mediet med 300 mikroliter serumfritt medium som inneholder den respektive mengden av viruset. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid i minst 2 timer.

Fjern inoculum og tilsett 1 milliliter DMEM med 10 prosent FBS og fortsett inkubasjonen. På relevante tidspunkter etter infeksjon høste viral progyny ved å direkte skrape celler inn i mediet. Overfør innhold fra hver brønn til et enkelt rør.

Snap fryse i flytende nitrogen og lagre på 80 grader Celsius til titrering og deretter fortsette som beskrevet i manuskriptet. For å begynne evalueringen av BTE indusert cellemediert cytotoksisitet ved LDH-utgivelse, må du først isolere utskillede transgenprodukter uttrykt av virusinfiserte målceller og isolere immuneffektorceller som beskrevet i manuskriptet. Deretter frø målceller i en U-bunn 96 veggplate og inkludere prøver som beskrevet i manuskriptet.

Tilsett tidligere isolerte immunmodulatorer ved ønskede konsentrasjoner til de respektive prøvene. Tilsett immunavhopperceller ved ønskede forholdstall og tilsett medium til et totalt volum på 100 mikroliter per brønn. Inkuber for de ønskede tidligere bestemte tidsrammene ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid.

45 minutter før prøveinnsamlingen legger til 10 mikroliter 10X Lysis-løsning i brønner som inneholder T max-prøver og tilsvarende mediumkontroller og fortsetter inkubasjonen. Sentrifuger cellene ved 250 ganger G i 4 minutter. Overfør 50 mikroliter supernatant fra hver brønn til brønner av en flat bunn 96 veggplate, og pass på at du ikke overfører cellene.

Etter å ha forberedt substratløsning i henhold til produsenten, legg til 50 mikroliter til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 30 minutter eller til T max prøver blir dype røde. Etter inkubasjon tilsett 50 mikroliter stoppløsning til hver brønn.

Sentrifuge i 1 minutt ved 4000 ganger G og bruk deretter en uthult nål for å fjerne luftbobler. Mål optisk absorbans ved 490 nanometer og beregn som beskrevet i manuskriptet. Etter inokulasjon med uendret og BTE koding onkolytiske meslinger virus vekst kurver av sammenlignet vektorer på vero celler vises lik.

Celle levedyktighet kurver på mc38 murine kolorektal karsinom celler stabilt uttrykker menneskelig karsinobryonic antigen og MV reseptorer CD46 etter inokulasjon viser at lytisk aktivitet av transgen koding viruset henger etter i murine tumor celle linje. Flow cytometri av målantigen uttrykke celler inkubert med BTE’s ved fem forskjellige fortynninger viste BTE binding av celler på en konsentrasjonsavhengig måte. I immunoblot etter magnetisk nedtrekk av BTE tilknyttede celler viste at når ikke målretting BTE ble brukt var det ingen påviselige mengder celler;mens når målretting BTE prøver ble brukt bundet celler var til stede i elution brøksjon.

BTE mediert målantigenspesifikk og konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet av murine T-celler indikeres ved representativ LDH-frigjøringsanalyse og viser at i det nåværende eksempelet ble 15 prosent spesifikt celledrap oppnådd ved en relativt høy BTE-konsentrasjon på 1 mikrogram per milliliter sammenlignet med referanseceller. Mens du prøver denne prosedyren, Er det viktig å huske å regelmessig overvåke celler for å sjekke utviklingen av infeksjon. Ikke glem at rekombinante meslingvaksinestammer, selv om de dempes, kan være farlige, spesielt for immunsupprimerte individer.

Unngå eksponering ved å følge de riktige biosikkerhetsprosedyrene. Personer som håndterer virus bør vaksineres før de utfører disse metodene. Etter denne prosedyren kan viralt uttrykk for ytterligere transgener oppnås for å analysere virusverter interaksjoner og terapeutiske effekter.

Utviklingen av disse teknikkene har banet vei for forskere innen bioterapi for å utforske effekten av lokalt uttrykte immunmodulatorer i mange tumorrike enheter;In Vitro, In Vivo, og også i kliniske studier.