Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Denna metod kan bidra till att ta itu med viktiga utmaningar inom cancer immunterapi genom att underlätta utvecklingen av onkolyktiska vektorer för riktade immunmodulering. Den största fördelen med det tillämpade omvända genetiska systemet är dess mångsidighet;därför kan vektorer anpassas för att ta itu med olika forskningsfrågor och måltumörer med olika immunsignaturer. De virus förökning steg särskilt bestämma den optimala tidspunkten att skörda virus är svåra att lära av ett textprotokoll eftersom syncytia bildning måste bedömas visuellt över tiden.

Att börja design och klona rekombinanta immunmodulerande vektorer som beskrivs i manuskriptet. Detta protokoll beskriver specifika steg för utveckling av en oncolytic mässling vaccin vektor, kodning en bispecific T-cell engager. För att rädda mässlingvirus från cDNA, 24 timmar före transfektionsplatta mässling virus producent celler jämnt på en 6 väggplatta.

Seed 200, 000 celler i 2 milliliter DMEM som innehåller 10 procent FBS per brunn för att uppnå 65 till 75 procent konfluency vid tidpunkten för transfection. Blanda 5 mikrogram rekombinant DNA-kodning av mässlingvirus antigenome som kommer att användas för att transfekt cellerna. Lämpliga plasmider och en fluorescerande reporter i en total volym på 200 mikroliter av DMEM.

Tillsätt 18,6 mikroliter av liposomalt transfection reagens till blandningen och omedelbart snärta röret för att blanda. Inkubera denna transfektionsmix i 25 minuter i rumstemperatur. Att transfekt MV producentcellerna ta bort mediet från 6 väl plattan odlas till 65 till 75 procent konfluency och lägga 1,8 milliliter DMEM med 2 procent FBS och 50 mikrogram per milliliter Kanamycin per brunn.

Tillsätt sedan transfektionsblandningen droppvis till varje brunn och snurra försiktigt. Inkubera cellerna över natten vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid. På följande dag ersätta mediet med 2 milliliter av färsk DMEM med 2 procent FBS och 50 mikrogram per milliliter Kanamycin och upprepa detta när medium blir surt igenkänd av den gula färgen.

Använd mikroskop för att observera celler dagligen för reporter genuttryck och syncytia bildning. När stora syncytia bestående av 20 eller fler celler är synliga eller när celler blir för tät skörd viruset. 24 timmar före den förväntade skörden utsäde cirka 1,5 miljoner MV producentceller i 12 milliliter av DMEM med 10 procent FBS på 10 centimeter rätter för att uppnå 65 till 75 procent konfluency vid tidpunkten för virusinokulering.

För att samla in viruset progyny använda en cell skrapa för att noggrant skrapa anhängare producentceller från 6 väggplattan med transfekterade celler. Överför mediet som innehåller de skrapade cellerna till ett centrifugrör. Centrifugera i minst 2500 gånger G och 4 grader Celsius i 5 minuter för att avlägsna cellskräp.

Efter centrifugeringen blanda cell-free supernatant med serum fria medium till en slutlig volym på 4 milliliter för att förbereda inokulat. Ta bort mediet från 10 centimeter skålen med MV producentceller och tillsätt inokulet till cellerna. Inkubera i minst 2 timmar vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid.

Efter inkubation tillsätt 6 milliliter DMEM med 10 procent FBS och inkubera celler över natten. Byt sedan ut mediet med 12 milliliter färsk DMEM med 10 procent FBS och inkubera vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid fram till skörden. Observera cellerna minst två gånger dagligen.

Innan syncytia brast när membran störningar blir synlig skörd viruset. Att skörda den första passagen ta bort supernatant från plattan och tillsätt 600 mikroliter av serum fria medium. Använd sedan en celllyftare för att skrapa cellerna och överföra till ett rent rör.

Omedelbart efter att frysa viruset suspension i flytande kväve och förvara på 80 grader Celsius i minst 24 timmar för att säkerställa grundlig frysning. För att bestämma titers av virus lager i oktuplikater per alikvot med hjälp av 96 väggplattor. Dra först producentcellerna från T75 cellodlingskolvar i 50 milliliter koniska rör.

Räkna cellerna och justera cellupphängningen till 150, 000 celler per milliliter i DMEM med 10 procent FBS. Tillsätt 90 mikroliter av DMEM med 10 procent FBS per brunn av en 96 väggplatta. Tillsätt sedan 10 mikroliter från en alikvot av virusstocken till alla 8 brunnarna i den första kolumnen i plattan.

Blanda noggrant genom pipettering upp och ner minst 10 gånger. Använd en flerkanalig pipett för att överföra 10 mikroliter av varje brunn, från den första till den andra kolumnen, och blanda noggrant genom pipettering upp och ner. Upprepa detta för varje kolumn för att erhålla seriell tiofaldig utspädning av viruset med hjälp av färska pipettspetsar för varje spädningssteg.

Kassera 10 mikroliter från varje brunn av den sista kolumnen. Tillsätt 100 mikroliter cellupphängning med 150, 000 celler per milliliter till varje brunn och se till att det inte finns några cellklump. Inkubera vid 37 grader Celsius, 5 procent koldioxid i 48 timmar.

Kontrollera om det finns syncytia med hjälp av ett ljusmikroskop. Räkna syncytia i varje brunn i kolumnen med den högsta utspädningsfaktorn som innehåller synlig syncytia. För virus som kodar en fluorescerande reporter kan syncytia räknas med hjälp av fluorescensmikroskopi.

För analys av mässlingvirus replikation kinetik en dag före infektionsfrö 100, 000 veroceller i 1 milliliter av DMEM med 10 procent FBS per brunn på 12 väggplattor med minst 2 brunnar för varje tidspunkt av intresse. För att infektera cellerna ersätta mediet med 300 mikroliter av serum fria medium som innehåller respektive mängd av viruset. Inkubera vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid i minst 2 timmar.

Ta bort inokulat och tillsätt 1 milliliter DMEM med 10 procent FBS och fortsätt inkubationen. Vid relevanta tidpunkter efter infektion skörd viral progyny genom att direkt skrapa celler i mediet. Överför innehåll från varje brunn till ett enskilt rör.

Snap frysa i flytande kväve och förvara i 80 grader Celsius tills titrering och fortsätt sedan som beskrivs i manuskriptet. För att påbörja utvärdering av BTE inducerad cell medierad cytotoxicitet genom LDH release, först isolera utsöndras transgena produkter uttryckt av virus infekterade målceller och isolera immun effektor celler som beskrivs i manuskriptet. Sedan utsäde målceller i en U-bottom 96 väggplatta och inkludera prover som beskrivs i manuskriptet.

Lägg till tidigare isolerade immunmodulatorer vid önskade koncentrationer till respektive prov. Lägg immun avhoppare celler vid önskade nyckeltal och lägga medium till en total volym av 100 mikroliter per brunn. Inkubera för de önskade tidigare bestämda tidsramarna vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid.

45 minuter före provinsamlingen tillför 10 mikroliter 10X Lyslösning till brunnar som innehåller T max prov och motsvarande medelreglage och fortsätt inkubationen. Centrifugera cellerna vid 250 gånger G i 4 minuter. Överför 50 mikroliter av supernatant från varje brunn till brunnar av en platt botten 96 väggplatta se till att inte överföra cellerna.

Efter att ha förberett substratlösning enligt tillverkaren tillsätt 50 mikroliter till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i mörker i 30 minuter eller tills T max prover blir djupt röda. Efter inkubation tillsätt 50 mikroliter av stopplösning till varje brunn.

Centrifugera i 1 minut vid 4000 gånger G och använd sedan en hålad nål för att avlägsna luftbubblor. Mät optisk absorbans vid 490 nanometer och beräkna enligt beskrivningen i manuskriptet. Efter inokulering med omodifierade och BTE kodning oncolytic mässling virus tillväxt kurvor av de jämförda vektorer på veros celler visas liknande.

Cellens livskraft kurvor på mc38 murine kolorektal carcinom celler stably uttrycker mänskliga carcinoembryonic antigen och MV receptorerna CD46 efter inokulering visar att lytic verksamhet av transgen kodning virus släpar efter i murine tumör cellinje. Flow cytometry av mål antigen uttrycker celler inkuberas med BTE: s vid fem olika utspädningar visade BTE bindande av celler i en koncentration beroende sätt. I immunoblot efter magnetiska dra ner av BTE associerade celler visade att när icke inriktning BTE: s användes fanns det inga påvisbara mängder celler;medan när inriktning BTE prover användes bundna celler var närvarande i elution fraktionen.

BTE medierad mål antigen specifik och koncentration beroende cytotoxicitet av murine T celler indikeras av representativa LDH frisättningsanalys och visar att i förevarande exempel 15 procent specifik cell avlivning uppnåddes vid en relativt hög BTE koncentration av 1 mikrogram per milliliter jämfört med referensceller. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att regelbundet övervaka celler för att kontrollera progression av infektion. Glöm inte att rekombinanta mässlingvaccin stammar även försvagade kan vara farliga särskilt för immun-undertryckta individer.

Undvik exponering genom att följa lämpliga rutiner för biosäkerhet. Individer som hanterar virus bör vaccineras innan de utför dessa metoder. Efter detta förfarande viral uttryck av ytterligare transgener kan uppnås i syfte att analysera virus värdar interaktioner och terapeutiska effekter.

Utvecklingen av dessa tekniker har banat väg för forskare inom bioterapi att utforska effekterna av lokalt uttryckta immunmodulatorer i många tumorous enheter;In Vitro, In Vivo, och även i kliniska prövningar.