Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Подготовка Poly(pentafluorophenyl acrylate) функционализированных SiO2 бусины очищение протеина
Chapters
Summary November 19th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Протокол для подготовки поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема бусины представлены. Функционализированных поверхность poly(PFPA) затем прикол с антителами и успешно используется для разделения белков через иммунопреципитации.
Transcript
Этот метод может быть использован для подготовки биомолекулы активированных поверхностей, которые имеют применение в таких областях, как доставка наркотиков, биологическое обнаружение цели, и био разделения. Основным преимуществом этого метода является то, что кисти поли PFPA очень реактивны с аминами, и иммобилизация антител достигается путем инкубации в буферном растворе в течение нескольких часов. Последствия этого метода распространяются на очищение белка путем иммунопрофилизации, так как иммобилизованные антитела могут успешно связываться с целевыми антигенами.
Хотя этот метод демонстрирует мобилизацию антител и очищение белка, он также может быть применен к другим системам, требующим биомолекулярной мобилизации. Для лечения диоксида кремния шарики с APTES, сначала получить частицы диоксида кремния в виде 5%weight объем aqueous подвески. Смешайте 0,8 миллилитров подвески диоксида кремния с 40 миллиграммами APTES и восемью миллилитров метанола в 20-миллилитровом сцинтилляционном флаконе, оснащенном батончиком для перемешивания.
Разрешить реакцию, чтобы продолжить при комнатной температуре в течение пяти часов с энергичным перемешиванием. Через пять часов перенесите раствор в коническую трубку. Чтобы изолировать функционализированные бусинки диоксида силикона, центрифуга раствора на 10 000 Г в течение пяти минут.
Затем удалите супернатант. Теперь мыть бисер, переочистив их в три миллилитров свежего метанола. Встряхните трубку вручную для смешивания, но при необходимости, улучшить дисперсию с помощью sonication в водяной бане в течение нескольких секунд.
Центрифуга, как и прежде, и повторить шаг мыть еще раз. Комбинат метанола мыть силиконовый диоксид бисера с тремя миллилитров диметилсуфсид, или DMSO. Встряхните смесь вручную, или, при необходимости, sonicate в течение нескольких секунд, пока шарики полностью рассеяны в DMSO.
После центрифугации раньше, удалить супернатант. Повторите шаг центрифуги в последний раз, чтобы обеспечить полный обмен растворителя от метанола до DMSO. Чтобы подготовить раствор поли ПФПА, растворите 20 миллиграммов поли ПФПА в двух миллилитров DMSO в 20 миллилитров сцинтилляционного флакона.
Чтобы подготовить раствор PEG, растворите амин функционализированный ПЭГ в одном миллилитре DMSO. Теперь перенесите решение PEG на раствор poly PFPA. Реагируть при комнатной температуре в течение одного часа с энергичным перемешиванием.
Перенесите один миллилитр функционализированных бусинок диоксида кремния APTES, подвешенных в DMSO, в раствор PEG, заменяемый поли PFPA. Разрешить прививки между поли PFPA и APTES функционализированных бусинок диоксида кремния, чтобы продолжить при комнатной температуре в течение одного часа с энергичным перемешиванием. Затем изолировать бисер центрифугой при 10 000 Г в течение пяти минут, а затем удаление супернатанта.
Вымойте бисер, добавив три миллилитров DMSO, и перемешать вручную или с помощью нескольких секунд sonication. Центрифуга бисера, как и раньше. И удалить супернатант, прежде чем повторить DMSO мыть дважды.
Вымойте бисер в два раза больше с тремя миллилитров тройной дистиллированной воды. Затем смешайте вручную или с помощью нескольких секунд звуковой связи. Центрифуга бисера, как и раньше, и удалить супернатант.
Наконец высушите бисер при температуре 40 градусов по Цельсию в вакуумной печи на ночь. Добавьте пять миллиграммов поли PFPA привитых бусин диоксида кремния в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки. Вымойте бисер, добавив 800 микролитров PBS, и хорошо перемешать вихрем.
Центрифуга бисера при температуре 10 000 Г при комнатной температуре в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторите шаг мытья три раза. Теперь добавьте 350 микролитров свежего PBS, 50 микролитров 0,1%PBST и 6,67 микрограмма антител.
Инкубировать около 20 часов на ротатор при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, мыть бисер и центрифугу при 400 G и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Затем удалите супернатант и аккуратно добавьте 400 микролитров буфера лиза.
Аккуратно resuspend шарики путем pipetting вверх и вниз пять раз. Повторите этот шаг мытья три раза. После окончательной стирки удалите как можно больше супернатанта.
Подготовка ячеек и буфера лиза, как описано в текстовом протоколе. Затем повторно посовещение клеточной гранулы с 400 микролитров буфера лиза. Sonicate клетки с помощью ультра sonicator.
После звуковой, вихрь кратко. Затем центрифуга лисировать при 20 000 Г при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую, 1,5 миллилитровую центрифугу.
Для выполнения иммунопреципиентации перенесите 300 микролитров клеточного лизата на ранее подготовленные антитела иммобилизованных поли ПФПА, привитых бусинками диоксида кремния. Сохраните 30 микролитров лизайта клетки в качестве входного образца в новой микроцентрифугной трубке. Инкубировать смесь лисатных бусин в течение трех часов на ротатор при четырех градусах по Цельсию.
После инкубации центрифуга смеси при 400 Г при четырех градусах цельсия в течение одной минуты. Удалите супернатант и аккуратно добавьте 400 микролитров буфера для мытья. Аккуратно resuspend шарики по трубопроводу вверх и вниз около пяти раз.
После трех моет, удалить как можно больше супернатантов, как это возможно. Добавьте 30 микролитров 2x SDS погрузочного красителя в бисер и в образец ввода. Затем нагрейте их в течение 10 минут при температуре 95 градусов по Цельсию.
После нагрева проанализируйте образец с помощью западного blotting, или хранить образец при минус 20 градусов по Цельсию. Функциональные бусинки кремнезема изучаются рентгеновской фотоэлектроно-спектроскопией, или XPS, для определения состава поверхности. Репрезентативные данные XPS показаны здесь.
После лечения APTES, пик азота 1s, связанный с зоной группы амина APTES обнаруживается. После поли PFPA лечения, фтор 1s пик, связанный с PFP единиц на полимере обнаруживается. Белка киназы РНК активирована, или PKR обогащения через иммунопреципиентации выполняется, и ссылаются образца белка анализируются с помощью западных blotting.
Как и ожидалось, бисер обездвижен без антител, или неспецифические антитела mixuture показать не PKR восстановления. Бисер, инкубированный анти-PKR, может успешно обогатить PKR, о чем свидетельствует наличие группы PKR и отсутствие группы GAPDH. При попытке этой процедуры, важно помнить, что при сравнении систем, IP эксперименты, а также последующий западный анализ blotting должно быть сделано одновременно.
После его разработки этот метод можно использовать для иммобилизации различных биомолекулярных или материальных субстратов. Кроме того, этот метод имеет дополнительное преимущество настройки только поверхностного свойства, которое должно быть адаптировано в соответствии с потребностью каждого приложения.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
