Manipulation av geners funktion i mexikanska släktet

Grottdjur ger ett övertygande system för att undersöka olika morfologiska, utvecklingsmässiga och beteendemässiga egenskaper. Men en av de begränsande faktorerna för att etablera detta modellsystem är en brist på genetiska verktyg som skulle tillåta oss att manipulera genfunktionen. Här visar vi tre olika tillvägagångssätt för att manipulera genfunktion i den mexikanska grottfisken, Astyanax mexicanus.

Dessa verktyg kommer att möjliggöra undersökningen av de gener som ligger bakom naturliga variationer mellan ytfisk och grottfisk och hur de relaterar till fenotyper. Bethany Stahl, en begåvad postdoc i mitt laboratorium kommer att visa detta förfarande. Innan du börjar förfarandet, fyll en 100 milliliter Petri skålen med varma 3%agaros upplöst i fisk system vatten och försiktigt placera ett ägg injektion mögel i agaros i 45 graders vinkel, innan sakta sänka formen i agaros för att undvika att fånga luft under formen.

När agarose har stelnat, försiktigt bort formen sedan lagra plattan på fyra grader Celsius i upp till en vecka. Dra sedan nålar från borosilikat glas kapillärer och en elektrod nål puller enligt tillverkarens riktlinjer. På dagen för injektionen, använd en glaspipett för att överföra encelliga ägg i injektionsplattan, fylla upp till fem rader av injektionsplattan med 30 till 40 ägg per rad.

Håll äggen hydrerade med en liten mängd fisksystem vatten. Tina Morpholino på is och bered injektionslösningen så att 400 pikogram av Morpholino injiceras per ägg genom att använda en lång Microloader pipettspets eller lägga till en två till fyra microliter bolus till slutet. När alla nålar har laddats, använd tövjärtor för att trimma överskottslängden från injektionsnålsspetsarna och montera den första nålen till en mikromanipulator ansluten till en picoliter mikroinjector.

Placera sedan injektionsfatet under ett dissekerande mikroskop och använd mikromanipulatorn för att penetrera varje ägg med nålen innan du injicerar en nanoliter av Morpholino-injektionslösning direkt i äggulan. För CRISPR-injektion, blanda 25 piogram av guide-RNA med 300 pikogram av CRISPR-associerat protein 9 messenger RNA och injicera två nanoliter av den resulterande RNA-lösningen i varje embryo som det visas. För Tol2 transposase och Tol2 flankerad plasmid injektion, kombinera 25 nanogram per mikroliter av Tol2 messenger RNA med 25 nanogram per mikroliter tol2 plasmid konstruera och fenol röd i RNase-fritt vatten.

Injicera sedan en nanoliter lösning i varje embryo som just visats. För att screena de Morpholino-injicerade djuren vid fyra dagars efterinjektion, beroende på den gen av intresse, visualisera fisklarverna under ett stereomikroskop för att observera fenotypen av de injicerade djuren eller videoskivan för att mäta beteende. För att screena för CRISPR-indels, för över CRISPR-injicerade embryon i PCR-rör och extrahera DNA:t enligt vanliga DNA-extraktionsprotokoll för polymeraskedjereaktion eller PCR-analys.

För att bedöma för mutagenes, kör fem mikroliter av PCR-produkten på en 3%agarosgel vid 70 volt i tre timmar. Vild-typ, icke-mutagenized DNA kommer att resultera i ett distinkt band, medan mutant DNA kommer att resultera i ett smeary band. Cave En mexicanus injiceras med en kontroll Morpholino uppvisar betydligt mer rörelseaktivitet och minskad sömn under en 24-timmarsperiod, jämfört med ytfisk injiceras med en förvrängd Morpholino.

Injektionen av hypokretinmalxinet Morpholino har liten effekt på sömnen i ytfisk jämfört med kontrollinjicerad fisk. Däremot har hypocretin orexin knockdown via Morpholino injektion en betydande effekt på sömn i grotta-bostad fisk, vilket ger en direkt koppling mellan hypocretin orexin uttryck och sömnförlust. CRPSR-medierad mutagenes av albinism genen OCA2 i ytan fisk resulterar i vissa individer homozygous för vild-typ OCA2 positiv allel, och är associerad med hyser pigmentering, medan individer som har två kopior av CRISPR-muterade OCA2 negativ allel är albino, vilket ger en direkt koppling mellan den muterade OCA2 genen och albinism i grotta fisk.

Välj F0:s positiva för den Överförda Tol2-transgenen till ryggkorset till vildtypen för att generera stabila F1-linjer. Detta möjliggör levande kalcium avbildning för att avslöja skillnader i neuronal aktivitet, medla beteendeförändringar i grottan miljön, lägga grunden för uttryck av många ytterligare transgener att karakterisera och manipulera genfunktion i A mexicanus. De viktigaste sakerna att komma ihåg är att ladda äggen tätt på plattan, att trimma nålen ordentligt, och att optimera microinjection.

Efter en lyckad genetisk knockdown, transgen integration, eller CRISPR-medierad genredigering, dessa fiskar kan användas för utvecklingsmässiga, beteendemässiga och hjärnans aktivitet analyser.