Biochemistry
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Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II
Chapters
Summary June 16th, 2019
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Le profilage protéomique des protéines tyrosine-nitrated a été une technique provocante due à la basse abondance de la modification de 3-nitrotyrosine. Ici nous décrivons une approche nouvelle pour l'enrichissement et le profilage de nitropeptide en utilisant Angiotensin II comme modèle. Cette méthode peut être étendue à d'autres systèmes in vitro ou in vivo.
Transcript
Ce message qui peut aider à répondre à des questions clés sur la façon d’enrichir et d’identifier les nitropeptides par une approche chimique et la spectrométrie de masse. Cette technique a une sensibilité accrue pour détecter les nitropéptides par spectrométrie de masse et qui peut être appliquée à la fois aux systèmes biochimiques in vitro et aux tissus biologiques endogènes. Pour le desalting nitro-angiotensine II, utilisez un tuyau d’un millilitre pour conditionner une extraction en phase solide en phase inverse ou une colonne SPE avec l’ajout de 500 microlitres de méthanol et de 500 microlitres d’eau dans le haut de la colonne.
Lorsque toute l’eau a traversé la colonne, chargez 410 microlitres de solution nitro-angiotensine II sur la colonne. Lavez la colonne avec 500 microlitres de 5% de méthanol et d’eau et 300 microlitres de 80% de méthanol et d’eau pour élucider le nitropeptide. Ensuite, séchez l’allongement par vide de vitesse dans le réglage par défaut à température ambiante.
Pour l’alkylation primaire d’amine, reconstituer la solution en poudre de bicarbonate de nitro-angiotensin II dans 100 microlitres de la solution bicarbonate de triéthylammonium de 100 millimolar et ajouter 400 microlitres de formaldéhyde de 4% à la solution dans une hotte de fumée avec le mélange bref. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de cyanoborohydride de sodium molaire de 0,6 molaire à la solution en secouant à 400 rotations par minute pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étanchez la réaction d’étiquetage avec 16 microlitres de solution d’ammoniac de 1% pendant cinq minutes à température ambiante suivie de l’acidification avec huit microlitres d’acide formique.
Ensuite, désaltrez la solution dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme nous venons de le démontrer. Pour que la nitrotyrosine soit réduite à l’aminotyrosine, reconstituez la nitro-angiotensine II étiquetée diméthyle dans 500 microlitres de PBS et ajoutez 10 microlitres d’un dithionate de sodium molaire pendant une heure d’incubation à température ambiante. Après la réaction de réduction, la solution jaune deviendra claire.
Desalt l’échantillon réduit dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme démontré. Pour la biotinylation et l’enrichissement, reconstituer l’aminoangiotensine II étiquetée diméthyle dans 500 microlitres de PBS suivie de l’ajout de cinq microlitres de 40 nanomolaires NHS-S-S biotine dissous dans du sulfoxyde de diméthyle pendant une incubation de deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, étancher la réaction avec un microlitre de 5% d’hydroxylamine et ajouter 500 microlitres de PBS frais à 100 microlitres de perles Streptavidin Agarose pour l’équilibrage par trois centrifugations distinctes.
Après la dernière centrifugation, ajouter 100 microlitres de perles au système de réaction pendant une incubation d’une heure sur un Shaker Rotary à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver le système quatre fois avec 500 microlitres de PBS frais par lavage suivi de l’ajout de 400 microlitres de 10 millimolar dithiothreitol pour une incubation de 45 minutes à 50 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faites tourner la colonne et transférez le supernatant dans un nouveau tube contenant 20 microlitres d’iodoacetamide molaire de 0,5 molaire pour une incubation de 20 minutes dans l’obscurité.
Puis désaltrer la solution dans une nouvelle colonne SPE en phase inverse comme démontré et résoudre le peptide sec dans 20 microlitres de 0,1% d’acide formique. Pour la détection, chargez le produit sur un chromatographe liquide avec un spectromètre de masse tandem. Séparez les peptides angiotensine II modifiés par une elusion de gradient de 60 minutes à un débit de 0,3 microlitres par minute avec le système de chromatographie liquide à haute pression nano-haute pression qui est directement interface avec le spectromètre de masse haute résolution.
Dans le mode d’acquisition dépendant des données, définissez un spectre de masse de balayage complet unique dans le spectromètre de masse, suivi de 20 balayages de spectromètre de masse tandem dépendant des données à 28 % d’énergie de collision normalisée. Ouvrez ensuite les données des spectres de masse et identifiez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique a été effectuée avec succès. Ici, des spectres de masse représentatifs de l’angiotensine II avant et après chaque modification chimique comme démontré peuvent être observés.
Le poids moléculaire du composé est indiqué par les valeurs de rapport masse-charge du pic mono-isotope, ce qui indique que la modification chimique sur l’angiotensine II a été obtenue avec succès pour cette étape. Ici, le produit final tel que détecté et caractérisé par la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse tandem est montré. L’analyse quantitative des nitropeptides par l’étiquetage du diméthyle permet de calcul des quantités relatives de lumière et de lourd par comparaison de l’intensité du pic mono-isotopique dans chaque groupe, permettant la quantification des nitropeptides enrichis de différents groupes.
Après la procédure, vous pouvez utiliser un moteur de recherche de programme tel que le compte maximum SEQUEST de pFIND pour identifier les nitropeptides potentiels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie au démarrage des fonctions biologiques de sites de nitration spécifiques.
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