Biochemistry
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Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II
Chapters
Summary June 16th, 2019
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El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o in vivo.
Transcript
Este mensaje puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo enriquecer e identificar los nitropéptidos mediante un enfoque químico y la espectrometría de masas. Esta técnica tiene una sensibilidad mejorada para detectar nitropéptidos por espectrometría de masas y que se puede aplicar tanto a los sistemas bioquímicos in vitro como a los tejidos biológicos endógenos. Para la desalado de nitro-angiotensina II, utilice una pipeta de un mililitro para precondicionar una extracción en fase inversa de fase sólida o columna SPE con la adición de 500 microlitros de metanol y 500 microlitros de agua en la parte superior de la columna.
Cuando toda el agua haya pasado por la columna, cargue 410 microlitros de solución de nitro-angiotensina II en la columna. Lavar la columna con 500 microlitros de 5% metanol y agua y 300 microlitros de 80% metanol y agua para eluir el nitropéptido. A continuación, seque el eluido por vacío de velocidad en el ajuste predeterminado a temperatura ambiente.
Para la alquilación de amina primaria, reconstituir la nitro-angiotensina II en polvo en 100 microlitros de 100 mililitros de solución de bicarbonato de trietilammonio y añadir 400 microlitros de 4% de formaldehído a la solución en una campana de humo con una breve mezcla. A continuación, agregue cuatro microlitros de 0,6 molar de cianoborohidruro sódico a la solución con agitación a 400 rotaciones por minuto durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, apagar la reacción de etiquetado con 16 microlitros de 1% solución de amoníaco durante cinco minutos a temperatura ambiente seguido de acidificación con ocho microlitros de ácido fórmico.
A continuación, desalque la solución en una nueva columna SPE de fase inversa como se acaba de demostrar. Para la reducción de nitrotirosina a aminotirosina, reconstituir la nitro-angiotensina II con etiqueta dimetil en 500 microlitros de PBS y añadir 10 microlitros de un ditionato de sodio molar durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Después de la reacción de reducción, la solución amarilla se aclarará.
Desalto la muestra reducida en una nueva columna SPE de fase inversa como se ha demostrado. Para la biotinilación y el enriquecimiento, reconstituya la aminoangiotensina II con dimetil-etiqueta en 500 microlitros de PBS seguida de la adición de cinco microlitros de 40 nanomolares NHS-S-S biotina disueltos en dimetil sulfóxido durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, apagar la reacción con un microlitro de 5%hidroxiamina y añadir 500 microlitros de PBS fresco a 100 microlitros de Streptavidin Agarose perlas para el equilibrio por tres centrifugaciones separadas.
Después de la última centrifugación, añadir 100 microlitros de cuentas al sistema de reacción durante una hora de incubación en un agitador rotativo a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave el sistema cuatro veces con 500 microlitros de PBS frescos por lavado seguido de la adición de 400 microlitros de 10 ditiothreitol militrolares para una incubación de 45 minutos a 50 grados centígrados. Al final de la incubación, gire hacia abajo la columna y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo que contenga 20 microlitros de 0,5 yodoacetamida molar para una incubación de 20 minutos en la oscuridad.
A continuación, desalcar la solución en una nueva columna SPE de fase inversa como se ha demostrado y resolver el péptido seco en 20 microlitros de 0,1%ácido fórmico. Para la detección, cargue el producto en un cromatógrafo líquido con un espectrómetro de masas en tándem. Separe los péptidos modificados de angiotensina II por un elusión de gradiente de 60 minutos a un caudal de 0,3 microlitros por minuto con el sistema de cromatografía líquida de nano alta presión que está directamente interconectado con el espectrómetro de masas de alta resolución.
En el modo de adquisición dependiente de datos, establezca un único espectro de masa de escaneo completo en el espectrómetro de masas, seguido de 20 escaneos de espectrómetro de masa en tándem dependientes de datos con un 28% de energía de colisión normalizada. A continuación, abra los datos de espectros de masa e identifique los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito. Aquí, se pueden observar espectros de masa representativos de angiotensina II antes y después de cada modificación química como se ha demostrado.
El peso molecular del compuesto está indicado por los valores de relación masa-carga del pico de isótopo mono, lo que indica que la modificación química de la angiotensina II se logró con éxito para ese paso. Aquí, se muestra el producto final tal como se detecta y se caracteriza por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem. El análisis cuantitativo de los nitropéptidos mediante dimetil-etiquetado permite calcular las cantidades relativas de luz y pesadas a través de la comparación de la intensidad del pico de isótopos mono en cada grupo, permitiendo la cuantificación de los nitropéptidos enriquecidos de diferentes grupos.
Siguiendo el procedimiento, puede utilizar un motor de búsqueda de programas como el recuento máximo SEQUEST de pFIND para identificar los nitropéptidos potenciales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para el inicio de las funciones biológicas de sitios específicos de nitración.
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