Biochemistry
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Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II
Chapters
Summary June 16th, 2019
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Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.
Transcript
Diese Nachricht, die helfen kann, wichtige Fragen zu beantworten, wie Nitropeptide durch einen chemischen Ansatz und die Massenspektrometrie zu bereichern und zu identifizieren. Diese Technik hat eine erhöhte Empfindlichkeit für den Nachweis von Nitropeptiden durch Massenspektrometrie und kann sowohl auf biochemische In-vitro-Systeme als auch auf endogene biologische Gewebe angewendet werden. Für die Nitro-Angiotensin-II-Entsalzung verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um eine Reverse-Phase-Festphasenextraktion oder SPE-Säule mit zugabe von 500 Mikrolitermethanol und 500 Mikroliter Wasser in die Oberseite der Säule vorzukonditionieren.
Wenn das gesamte Wasser durch die Säule gelaufen ist, laden Sie 410 Mikroliter Nitro-Angiotensin II-Lösung auf die Säule. Waschen Sie die Säule mit 500 Mikroliter5%Methanol und Wasser und 300 Mikroliter 80% Methanol und Wasser, um das Nitropeptid zu löschen. Dann trocknen Sie das Eluat durch Geschwindigkeitsvakuum in der Standardeinstellung bei Raumtemperatur.
Zur primären Aminalkylierung das pulverisierte Nitro-Angiotensin II in 100 Mikrolitern 100 Millimolar Triethylammonium bicarbonat-Lösung rekonstituieren und 400 Mikroliter 4%Formaldehyd in einer Dunstabzugshaube mit kurzer Mischung in die Lösung geben. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter 0,6 Mol-Natriumcyanoborohydrid in die Lösung mit Schütteln bei 400 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Etikettierreaktion mit 16 Mikrolitern 1%Ammoniaklösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur und anschließender Versauerung mit acht Mikroliter Ameisensäure ablöschen.
Dann entsalzen Sie die Lösung in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule, wie gerade gezeigt. Für Nitrotyrosin zur Aminotyrosinreduktion das Dimethyl-markierte Nitro-Angiotensin II in 500 Mikroliter PBS rekonstituieren und 10 Mikroliter eines molaren Natriumdithionats für eine eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Nach der Reduktionsreaktion wird die gelbe Lösung klar.
Die reduzierte Probe in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule zu entalten, wie gezeigt. Zur Biotinylierung und Anreicherung wird das dimethylmarkierte Aminoangiotensin II in 500 Mikroliter PBS rekonstituiert, gefolgt von der Zugabe von fünf Mikrolitern 40 nanomolarem NHS-S-S-Biotin, das in Dimethylsulfoxid für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur gelöst ist. Am Ende der Inkubation die Reaktion mit einem Mikroliter 5%Hydroxylamin abschrecken und 500 Mikroliter frisches PBS zu 100 Mikroliter Streptavidin Agarose Perlen für die Äquilibation durch drei separate Zentrifugationen hinzufügen.
Nach der letzten Zentrifugation 100 Mikroliter Perlen für eine einstündige Inkubation auf einem Rotary Shaker bei Raumtemperatur in das Reaktionssystem geben. Am Ende der Inkubation waschen Sie das System viermal mit 500 Mikrolitern frischer PBS pro Wäsche, gefolgt von der Zugabe von 400 Mikrolitern 10 Millimolar Dithiothreitol für eine 45-minütige Inkubation bei 50 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Säule nach unten drehen und den Überstand in ein neues Rohr mit 20 Mikrolitern 0,5 Moliodoacetamid für eine 20-minütige Inkubation im Dunkeln übertragen.
Dann die Lösung in einer neuen Reverse-Phase-SPE-Säule entsalzen, wie gezeigt, und lösen Sie das trockene Peptid in 20 Mikroliter 0,1% Ameisensäure. Zur Detektion laden Sie das Produkt auf einen Flüssigchromatographen mit einem Tandem-Massenspektrometer. Trennen Sie die modifizierten Angiotensin-II-Peptide durch eine 60-minütige Gradientenelusion bei einer Durchflussrate von 0,3 Mikroliter pro Minute mit dem Nanohochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem, das direkt mit dem hochauflösenden Massenspektrometer in Verbindung steht.
Legen Sie im datenabhängigen Erfassungsmodus ein einzelnes vollständiges Scanmassenspektrum im Massenspektrometer fest, gefolgt von 20 datenabhängigen Tandem-Massenspektrometern-Scans mit 28 % normalisierter Kollisionsenergie. Öffnen Sie dann die Massenspektrendaten und identifizieren Sie die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich durchgeführt wurde. Hierkönnen repräsentative Massenspektren von Angiotensin II vor und nach jeder chemischen Veränderung beobachtet werden.
Das Molekulargewicht der Verbindung wird durch die Massen-Zu-Ladungs-Verhältniswerte des Monoisotopen-Peaks angezeigt, was darauf hindeutet, dass die chemische Modifikation an Angiotensin II für diesen Schritt erfolgreich erreicht wurde. Hierwird wird das Endprodukt gezeigt, das durch eine flüssige Chromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie nachgewiesen und gekennzeichnet ist. Die quantitative Analyse der Nitropeptide durch Dimethyl-Etikettierung ermöglicht die Berechnung der relativen Mengen an Licht und schweren durch Vergleich der Intensität des Monoisotopenspitzen in jeder Gruppe, was die Quantifizierung der angereicherten Nitropeptide aus verschiedenen Gruppen ermöglicht.
Im Verlauf des Verfahrens können Sie eine Programmsuchmaschine wie die maximale Anzahl von pFIND sEQUEST verwenden, um die potenziellen Nitropeptide zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Beginn der biologischen Funktionen bestimmter Nitrationsstellen.
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