Biochemistry
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Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II
Chapters
Summary June 16th, 2019
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La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.
Transcript
Questo messaggio che può aiutare a rispondere a domande chiave su come arricchire e identificare i nitropeptidi con un approccio chimico e la spettrometria di massa. Questa tecnica ha una maggiore sensibilità per il rilevamento dei nitropeptidi mediante spettrometria di massa e che può essere applicata sia ai sistemi biochimici in vitro che ai tessuti biologici endogeni. Per la desalizzazione nitro-angiotensina II, utilizzare una pipetta millilitro per precondizione di un'estrazione in fase solida in fase inversa o colonna SPE con l'aggiunta di 500 microlitri di metanolo e 500 microlitri di acqua nella parte superiore della colonna.
Quando tutta l'acqua ha attraversato la colonna, caricare 410 microlitri di soluzione di nitro-angiotensina II sulla colonna. Lavare la colonna con 500 microlitri di 5%metanolo e acqua e 300 microlitri dell'80% di metanolo e acqua per elutare il nitropeptide. Quindi asciugare l'eluato per vuoto di velocità nell'impostazione predefinita a temperatura ambiente.
Per l'alchilazione primaria dell'ammina, ricostituire la nitro-angiotensina II in polvere in 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di Trietilammonio da 100 millimolare e aggiungere 400 microlitri di formaldeide al 4% alla soluzione in una cappa fumi con breve miscelazione. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di cianoboroidro di sodio molare 0,6 alla soluzione con scuotimento a 400 rotazioni al minuto per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione di etichettatura con 16 microlitri di soluzione di ammoniaca all'1% per cinque minuti a temperatura ambiente seguita da acidificazione con otto microlitri di acido formico.
Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come appena dimostrato. Per la riduzione della nitrotirosina in amminotirosina, ricostituire la nitro-angiotensina II con etichetta dimetile in 500 microlitri di PBS e aggiungere 10 microlitri di un ditionato di sodio molare per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Dopo la reazione di riduzione, la soluzione gialla diventerà chiara.
Desalt il campione ridotto in una nuova colonna SPE in fase inversa, come dimostrato. Per la biotinilazione e l'arricchimento, ricostituire l'amminoangiotensina II a marchio dimetile in 500 microlitri di PBS seguita dall'aggiunta di cinque microlitri di biotina NHS-S-S nanomolare sciolta in solfossido di dimetile per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione con un microlitro di idrossilammina al 5% e aggiungere 500 microlitri di PBS fresco a 100 microlitri di perline di agarosio Streptavidin per l'equilibrazione mediante tre centrifugazioni separate.
Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di perline al sistema di reazione per un'incubazione di un'ora su uno shaker rotativo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare il sistema quattro volte con 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio seguito dall'aggiunta di 400 microlitri di 10 millimolare ditiothreitol per un'incubazione di 45 minuti a 50 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, girare lungo la colonna e trasferire il supernatante in un nuovo tubo contenente 20 microlitri di iodoacetamide molare 0,5 per un'incubazione di 20 minuti al buio.
Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come dimostrato e risolvere il peptide secco in 20 microlitri dello 0,1% di acido formico. Per il rilevamento, caricare il prodotto su un cromatografo liquido con uno spettrometro di massa tandem. Separare i peptidi di angiotensina II modificati con un'elusione gradiente di 60 minuti ad una portata di 0,3 microlitri al minuto con il sistema di cromatografia liquida ad altissima pressione che è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
Nella modalità di acquisizione dipendente dai dati, impostare un singolo spettro di massa di scansione completo nello spettrometro di massa, seguito da 20 scansioni di massa tandem dipendenti dai dati con energia di collisione normalizzata al 28%. Quindi aprire i dati degli spettri di massa e identificare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è stata eseguita con successo. Qui si possono osservare spettri di massa rappresentativi di angiotensina II prima e dopo ogni modifica chimica dimostrata.
Il peso molecolare del composto è indicato dai valori del rapporto massa-carica del picco mono isotopico, indicando che la modifica chimica sull'angiotensina II è stata raggiunta con successo per quel passo. Qui viene mostrato il prodotto finale rilevato e caratterizzato da cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. L'analisi quantitativa dei nitropeptidi mediante etichettatura dimetile consente di calcolo delle quantità relative di luce e pesante attraverso il confronto dell'intensità del picco mono isotopico in ciascun gruppo, consentendo la quantificazione dei nitropeptidi arricchiti provenienti da diversi gruppi.
Seguendo la procedura, è possibile utilizzare un motore di ricerca del programma come il numero massimo SEQUEST di pFIND per identificare i potenziali nitropeptidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'inizio delle funzioni biologiche di specifici siti di nitrazione.
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