Biochemistry
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Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र
Chapters
Summary June 16th, 2019
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टायरोसिन-नाइट्रेटेड प्रोटीन की प्रोटीओमिक प्रोफाइलिंग 3-नाइटोटिरोसिन संशोधन की कम बहुतायत के कारण एक चुनौतीपूर्ण तकनीक रही है। यहाँ हम मॉडल के रूप में Angiotensin द्वितीय का उपयोग करके nitropeptide संवर्धन और रूपरेखा के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन. इस विधि इन विट्रो में अन्य के लिए या विवो सिस्टम में बढ़ाया जा सकता है.
Transcript
यह संदेश जो रासायनिक दृष्टिकोण और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निट्रोपेंटिड्स को समृद्ध और पहचानने के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है। इस तकनीक में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नाइट्रोपेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए एक बढ़ी हुई संवेदनशीलता है और इसे विट्रो बायोकेमिकल सिस्टम और अंतर्जात जैविक ऊतकों दोनों में लागू किया जा सकता है। नाइट्रो-एंजियोटेंसिन II डीसल्टिंग के लिए, कॉलम के शीर्ष में मेथनॉल के 500 माइक्रोलीटर और पानी के 500 माइक्रोलीटर के अलावा रिवर्स-चरण ठोस चरण निष्कर्षण या एसपीई कॉलम को पूर्व शर्त करने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें।
जब सभी पानी कॉलम के माध्यम से चला है, कॉलम पर नाइट्रो-एंजियोटेंसिन द्वितीय समाधान के ४१० माइक्रोलीटर लोड । कॉलम को 5% मेथनॉल और पानी के 500 माइक्रोलीटर और 80% मेथनॉल और पानी के 300 माइक्रोलीटर के साथ धोएं ताकि निट्रोपेप्टाइड को एल्यूट किया जा सके। फिर कमरे के तापमान पर डिफ़ॉल्ट सेटिंग में गति वैक्यूम द्वारा एलुएट सूखी।
प्राथमिक अमीन एल्किलेशन के लिए, 100 मिलीमोलर ट्राइथिलेलमोनियम बाइकार्बोनेट समाधान के 100 माइक्रोलीटर में पाउडर नाइट्रो-एंजियोटेनसिन II का पुनर्गठन करें और संक्षिप्त मिश्रण के साथ एक धूम हुड में समाधान के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए प्रति मिनट 400 घूर्णन पर मिलाते हुए समाधान के लिए 0.6 मोलर सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड के चार माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 1% अमोनिया समाधान के 16 माइक्रोलीटर के साथ लेबलिंग प्रतिक्रिया को बुझाएं और इसके बाद आठ माइक्रोलीटर फॉर्मिक एसिड के साथ एसिडिफिकेशन करें।
फिर समाधान को एक नए रिवर्स-चरण एसपीई कॉलम में डीसाल्ट करें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। नाइट्रोटिरोसिन को अमीनोटाइरोसिन में कमी के लिए, पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर में डाइमिथाइल-लेबल नाइट्रो-एंजियोटेंशनसिन II का पुनर्गठन करें और कमरे के तापमान पर एक घंटे इनक्यूबेशन के लिए एक मोलर सोडियम डायथिओनेट के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमी की प्रतिक्रिया के बाद, पीला समाधान स्पष्ट हो जाएगा।
प्रदर्शन के रूप में एक नए रिवर्स चरण एसपीई कॉलम में कम नमूना Desalt । बायोटिनिलेशन और संवर्धन के लिए, पीबीएस के ५०० माइक्रोलीटर में डाइमिथाइल-लेबल वाले अमीनोपेसिन II का पुनर्गठन करें और इसके बाद कमरे के तापमान पर दो घंटे इनक्यूबेशन के लिए डिमेथिल सल्फोक्साइड में भंग ४० नैनोमोलियर एनएचएस-एस-स् टाइन के पांच माइक्रोलीटर को जोड़ा गया । इनक्यूबेशन के अंत में, 5% हाइड्रोक्सिलमाइन के एक माइक्रोलीटर के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं और तीन अलग-अलग अपकेंद्री द्वारा संतुलन के लिए स्ट्रेप्टाविडिन एगरेग्यार के 100 माइक्रोलीटर में ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।
अंतिम अपकेंद्रित्र के बाद, कमरे के तापमान पर रोटरी शेकर पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्रतिक्रिया प्रणाली में मोतियों के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रति वॉश ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ चार बार सिस्टम को धोएं और इसके बाद 50 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 10 मिलीमोलर डियोथरेटोल के 400 माइक्रोलीटर को जोड़ा गया। इनक्यूबेशन के अंत में, कॉलम को स्पिन करें और सुपरनिट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें अंधेरे में 20 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए 0.5 मोलर इओडोएस्टामाइड के 20 माइक्रोलीटर होते हैं।
फिर एक नए रिवर्स-चरण एसपीई कॉलम में समाधान को डीसाल्ट करें और 0.1% फॉरमिक एसिड के 20 माइक्रोलीटर में सूखे पेप्टाइड को हल करें। पता लगाने के लिए, उत्पाद को एक टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ तरल क्रोमेग्राफर पर लोड करें। संशोधित एंजियोटेंसिन II पेप्टाइड्स को नैनो-हाई-प्रेशर लिक्विड क्रोमेटोग्राफी सिस्टम के साथ प्रति मिनट 0.3 माइक्रोलीटर की प्रवाह दर पर 60 मिनट के ढाल एलोज़न द्वारा अलग करें जो सीधे उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ जुड़ा हुआ है।
डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड में, मास स्पेक्ट्रोमीटर में एक पूर्ण स्कैन मास स्पेक्ट्रम सेट करें, इसके बाद 28% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा पर 20 डेटा-निर्भर टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमीटर स्कैन करें। फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा डेटा खोलें और रासायनिक प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक चरण में उत्पाद की चोटियों की पहचान सफलतापूर्वक किया गया है। यहां, प्रदर्शित प्रत्येक रासायनिक संशोधन से पहले और बाद में एंजियोटेंसिन II के प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रा को देखा जा सकता है।
यौगिक का आणविक वजन मोनो आइसोटोप चोटी के बड़े पैमाने पर चार्ज अनुपात मूल्यों द्वारा इंगित किया जाता है, जो यह दर्शाता है कि उस चरण के लिए एंजियोटेंसिन II पर रासायनिक संशोधन सफलतापूर्वक हासिल किया गया था। यहां, अंतिम उत्पाद के रूप में पता चला और मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ तरल क्रोमेटोग्राफी की विशेषता दिखाया गया है । डाइमेथिल-लेबलिंग द्वारा नाइट्रोपेप्टाइड्स का मात्रात्मक विश्लेषण प्रत्येक समूह में मोनो आइसोटोप चोटी की तीव्रता की तुलना के माध्यम से प्रकाश और भारी की सापेक्ष मात्रा की गणना की अनुमति देता है, जिससे विभिन्न समूहों से समृद्ध निट्रोपेप्टाइड्स की मात्रा होती है।
प्रक्रिया के बाद, आप संभावित नाइट्रोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए एक प्रोग्राम सर्च इंजन जैसे सेक्वेस्ट मैक्स काउंट ऑफ पीफाइंड का उपयोग कर सकते हैं। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने विशिष्ट नाइट्रेशन साइटों के जैविक कार्यों को शुरू करने का मार्ग प्रशस्त किया।
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