Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Journal (Biochemistry)

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Journal (Biochemistry)

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Click here for the English version

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Article DOI: 10.3791/59391-v

June 16th, 2019 •

Shan Feng^1,2, Xiaofei Wen³, Xin Lu^2,4,5,6

¹Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, ²Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ³Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, ⁴Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, ⁵Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, ⁶Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 16th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Proteomisk profilering av tyrosin-Nitrerade proteiner har varit en utmanande teknik på grund av det låga överflöd av 3-nitrotyrosin modifiering. Här beskriver vi en ny metod för nitropeptid berikning och profilering genom att använda angiotensin II som modell. Denna metod kan för längas för andra in vitro -eller in vivo -system.

Transcript

Detta meddelande som kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om hur man berikar och identifierar nitropeptider genom en kemisk strategi och masspektrometrin. Denna teknik har en förstärkt känslighet för att upptäcka nitropeptider genom masspektrometri och som kan appliceras på både in vitro biokemiska system och endogena biologiska vävnader. För nitro-angiotensin II-desalting, använd en en milliliter pipet för att prekonditionera en reverse-phase solid-phase extraktion eller SPE-kolonn med tillsats av 500 mikroliter metanol och 500 mikroliter vatten i kolonnens överkant.

När allt vatten har gått genom kolonnen, ladda 410 mikroliter av nitro-angiotensin II lösning på kolonnen. Tvätta kolonnen med 500 mikroliter av 5%metanol och vatten och 300 mikroliter av 80%metanol och vatten för att elituera nitropeptiden. Torka sedan eluatet genom hastighetsvakuum i standardinställningen vid rumstemperatur.

För primär aminalkylering, rekonstituera den pulveriserade nitro-angiotensin II i 100 mikroliters på 100 millimolar Triethylammonium bikarbonatlösning och tillsätt 400 mikroliter av 4%formaldehyd till lösningen i en fume huva med kort blandning. Därefter lägger du till fyra mikroliter på 0,6 molar natriumcyanoborohydrid till lösningen med skakningar vid 400 rotationer per minut under en timme vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, släcka märkningsreaktionen med 16 mikroliter av 1%ammoniaklösning i fem minuter vid rumstemperatur följt av försurning med åtta mikroliter av myrsyra.

Desalt sedan lösningen i en ny omvänd fas SPE kolumn som just visat. För nitrotyrosin till aminotyrosinreduktion, rekonstruera dimetylmärkt nitro-angiotensin II i 500 mikroliter av PBS och tillsätt 10 mikroliter av en molar natrium dithionat för en timmes inkubation vid rumstemperatur. Efter reduktionsreaktionen kommer den gula lösningen att bli klar.

Desalt det reducerade provet i en ny reverse-phase SPE-kolumn som visats. För biotinylation och anrikning, rekonstruera dimetylmärkta aminoangiotensin II i 500 mikroliter av PBS följt av tillsats av fem mikroliter av 40 nanomolar NHS-S-S biotin upplöst i dimetylsulfoxid för en två timmars inkubation vid rumstemperatur. Vid inkubationens, släck reaktionen med en mikroliter på 5%hydroxylamin och tillsätt 500 mikroliter färska PBS till 100 mikroliter streptavidin Agarose pärlor för jämvikten genom tre separata centrifugeringar.

Efter den sista centrifugeringen, tillsätt 100 mikroliter av pärlor till reaktionssystemet för en en timmes inkubation på en Roterande Shaker i rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta systemet fyra gånger med 500 mikroliter färska PBS per tvätt följt av tillsats av 400 mikroliter av 10 millimolar dithiothreitol för en 45 minuters inkubation vid 50 grader Celsius. I slutet av inkubationen snurrar du ner kolonnen och överför supernatanten i ett nytt rör som innehåller 20 mikroliter på 0,5 molar iodoacetamid för en 20 minuters inkubation i mörker.

Desalta sedan lösningen i en ny reverse-phase SPE-kolumn som den demonstreras och löse den torra peptiden i 20 mikroliter av 0,1%myrsyra. För detektion, lasta produkten på en vätskekromatograf med en tandemmasspektrometer. Separera de modifierade angiotensin II-peptiderna med en 60 minuters gradient elusion med en flödeshastighet på 0,3 mikroliter per minut med det nanohögtrycksvätgaskromatografisystem som är direkt gränssnittsbetonat med den högupplösta masspektrometern.

I det databeroende anskaffningsläget ställer du in ett enda fullständigt massspektrum i masspektrometern, följt av 20 databeroende tandemmasspektrometerskanningar vid 28%normaliserad kollisionsenergi. Öppna sedan massspektradata och identifiera produktens toppar i varje steg för att bekräfta att den kemiska reaktionen har utförts framgångsrikt. Här kan representativa masspektra av angiotensin II före och efter varje kemisk modifiering som påvisas observeras.

Molekylvikten för föreningen anges med mass-till-charge-kvotvärdena för monoisotoptoptoppen, vilket indikerar att den kemiska modifieringen på angiotensin II uppnåddes framgångsrikt för det steget. Här visas slutprodukten som detekterats och karakteriseras av vätskekromatografi med tandemmasspektrometri. Kvantitativ analys av nitropeptiderna genom dimetylmärkning möjliggör beräkning av de relativa mängderna ljus och tung via jämförelse av intensiteten hos monoisotoptoppen i varje grupp, vilket möjliggör kvantifiering av de berikade nitropeptiderna från olika grupper.

Efter förfarandet kan du använda ett program sökmotor såsom SEQUEST max räkning av pFIND att identifiera de potentiella nitropeptider. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för start av de biologiska funktionerna hos specifika nitrationsplatser.

X

Simple Hit Counter