Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني
Chapters
Summary June 16th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
وقد كان التنميط البروتيني للبروتينات التيروزين-نترات تقنية صعبة بسبب وفرة منخفضة من التعديل 3-nitrotyrosine. هنا نحن نوصف نهج جديد لإثراء nitropeptide والتنميط باستخدام أنجيوتنسين الثاني كنموذج. ويمكن توسيع هذه الطريقة لأنظمة أخرى في المختبر أو في الجسم الحي.
Transcript
هذه الرسالة التي يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية إثراء وتحديد النيتروببتيدات من خلال نهج كيميائي وقياس الطيف الشامل. هذه التقنية لديها حساسية معززة للكشف عن النتروبتيدات بواسطة قياس الطيف الكتلي والتي يمكن تطبيقها على كل من النظم الكيميائية الحيوية في المختبر والأنسجة البيولوجية الذاتية. بالنسبة لـ nitro-angiotensin II desalting، استخدم أنبوب ملليلتر واحد لشرط مسبق لاستخراج المرحلة الصلبة أو عمود SPE مع إضافة 500 ميكرولترات من الميثانول و 500 ميكرولترات من الماء في الجزء العلوي من العمود.
عندما تم تشغيل كل من المياه من خلال العمود، تحميل 410 ميكرولترات من نيترو أنجيوتنسين الثاني حل على العمود. غسل العمود مع 500 ميكرولترات من 5٪ الميثانول والماء و 300 ميكرولتر من 80٪ الميثانول والماء ل elute النيتروبتيد. ثم جفف الـ eluate بواسطة فراغ السرعة في الإعداد الافتراضي في درجة حرارة الغرفة.
بالنسبة لـ alkylation الأمين الأولية، إعادة تشكيل مسحوق نيترو-أنجيوتنسين الثاني في 100 ميكرولترات من 100 ملليمولار ثلاثية التوائميوم بيكربونات إضافة 400 ميكرولترات من 4٪ الفورمالديهايد إلى الحل في غطاء الدخان مع خلط وجيزة. بعد ذلك، إضافة أربعة ميكرولترات من 0.6 الصوديوم الصوديوم cyanoborohydride إلى الحل مع اهتزاز في 400 دوران في الدقيقة الواحدة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وإخماد رد فعل وضع العلامات مع 16 ميكرولترات من 1٪ الأمونيا حل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها التحمض مع ثمانية ميكرولترات من حمض الفورميك.
ثم desalt الحل في العمود الجديد مرحلة عكسية SPE كما أظهرت للتو. بالنسبة لنتروتيروسين للحد من أمينوتيروسين ، إعادة تشكيل ثنائي الميثيل المسمى نيترو أنجيوتنسين الثاني في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولترات من ديويونات الصوديوم الضرس واحد لمدة ساعة واحدة حضانة في درجة حرارة الغرفة. بعد رد فعل الحد، وسوف تصبح واضحة الحل الأصفر.
Desalt عينة مخفضة في العمود SPE عكس المرحلة الجديدة كما هو موضح. بالنسبة للثنائية الحيوية والإثراء ، إعادة تشكيل أمينوينجيوتنسين الثاني المسمى ثنائي الميثيل في 500 ميكرولتر من PBS يليه إضافة خمسة ميكرولترات من 40 نانومولار NHS-S-S-البيوتين المذابة في سلفوكسيد ثنائي الفينيل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وإخماد رد فعل مع ميكرولتر واحد من 5٪ هيدروسيلامين وإضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد إلى 100 ميكرولترات من الخرز Streptavidin أغاروز لتكدير من قبل ثلاثة طرد مركزي منفصلة.
بعد الطرد المركزي الأخير، أضف 100 ميكرولترات من الخرز إلى نظام التفاعل لمدة ساعة واحدة حضانة على شاكر الروتاري في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل النظام أربع مرات مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل تليها إضافة 400 ميكرولترات من 10 ثنائية 10 ملليمولار لاحتضان 45 دقيقة في 50 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، تدور أسفل العمود ونقل سوبرنانت إلى أنبوب جديد يحتوي على 20 ميكرولترات من 0.5 المول iodoacetamide لاحتضان 20 دقيقة في الظلام.
ثم desalt الحل في العمود SPE عكس المرحلة الجديدة كما أظهرت وحل الببتيد الجاف في 20 ميكرولترات من حمض فورميك 0.1٪. للكشف، قم بتحميل المنتج على كروماتوغرافي سائل مع مطياف كتلة جنبا إلى جنب. فصل الببتيدات المعدلة أنجيوتنسين الثاني من خلال 60 دقيقة من قبل تذري متدرج بمعدل تدفق 0.3 ميكرولترات في الدقيقة مع نظام الكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي نانو الذي يتم مباشرة مع مطياف الكتلة عالية الدقة.
في وضع الاقتناء المعتمد على البيانات، قم بإعداد طيف كتلة مسح كامل واحد في مطياف الكتلة، يليه 20 مسحًا متراطيًا جماعيًا مترادفًا يعتمد على البيانات بنسبة 28٪ من طاقة الاصطدام الطبيعية. ثم افتح بيانات الأطياف الكتلية وحدد قمم المنتج في كل خطوة لتأكيد أن التفاعل الكيميائي قد تم تنفيذه بنجاح. هنا، يمكن ملاحظة الأطياف الكتلة التمثيلية لأنجيوتنسين الثاني قبل وبعد كل تعديل كيميائي كما هو موضح.
ويُشار إلى الوزن الجزيئي للمركب بقيم نسبة الكتلة إلى الشحنة لذروة النظائر الأحادية، مما يشير إلى أن التعديل الكيميائي على أنجيوتنسين الثاني قد تحقق بنجاح لتلك الخطوة. هنا، يتم عرض المنتج النهائي كما تم اكتشافه وتميزه بالنظروماتوغرافيا السائلة مع قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. ويتيح التحليل الكمي للنيتروبتيدات بواسطة وضع علامات الدايم الديميثيل حساب الكميات النسبية من الضوء والثقيلة عن طريق المقارنة بين شدة ذروة النظائر الأحادية في كل مجموعة، مما يسمح بالتدبير الكمي للنيتروبتيدات المخصبة من مختلف المجموعات.
بعد الإجراء، يمكنك استخدام محرك بحث برنامج مثل عدد ماكس SEQUEST من pFIND لتحديد nitropeptides المحتملة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق لبدء الوظائف البيولوجية لمواقع nitration محددة.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
