Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征
Chapters
Summary June 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
我们使用强大的生化方法对一种新的激酶蛋白进行了定性:用特殊抗体对不同细胞系和组织进行西带体分析,通过共免疫沉淀实验相互作用,由西方检测到的激酶活性使用磷特异性抗体和由 β+32P+ ATP 标记的斑点。
Transcript
免疫沉淀是一种非常强大的技术，用于分离和纯化靶蛋白。在平滑条件下，蛋白质、调节器或基质可以共同免疫沉淀。然后，可能会发现一个新的交互网络。
免疫沉淀蛋白的活性也可以评估。特别是，激酶的活性可以通过P32-ATP标签在不同基材上进行测试。然而，针对与疾病有关激酶的抑制剂的活性可以进行评估。
它们可能构成开发新药的铅化合物。这种方法可以从哺乳动物扩展到酵母或细菌。这种技术并不难。
要点：确保具有负控制，以确保检测到的交互是特定的，并仔细选择解解条件以保持相互作用和活动。小细节和手势对于确保这项技术的成功非常重要，它们永远不会在文章的材料和方法中描述。演示程序将是法比安戈丁，一个技术员从我们的实验室。
在生物安全柜内的细胞培养室中准备细胞后，使用10毫升移液器将介质从盘子中去除，并丢弃在带漂白剂的专用废物瓶中。然后，加入10毫升新鲜补充的DMEM，并在37摄氏度时将盘子放回孵化器。为了准备转染混合物，在15毫升管中，在pH 7.5下加入450微升10毫摩尔三氧化盐溶液，辅以1毫摩尔EDTA和50微升2.5摩尔氯化钙溶液。
通过反转混合。进入管中，加入一个对应于10微克血浆DNA的体积，由DNA中滴答包扩增，并稀释与该试剂盒的洗脱缓冲液，其浓度已确定。反转管子混合。
然后，在涡流搅拌器上平滑搅拌，缓慢地加入500微升的 BES 缓冲盐水2X浓缩物，一滴一滴地滴入管中。小心移动，不要干扰DNA和磷酸钙之间的复杂形成。在室温下孵育至少15分钟，或长达45分钟。
现在，将板从培养箱转移到安全柜。将准备好的DNA复合物一滴一滴地添加到盘子表面的细胞上。在37摄氏度的孵化器中孵育24至72小时。
为了防止蛋白质降解，在冰上准备解液缓冲液，考虑每个转染板的四毫升解液缓冲液。从培养箱中取出带转染细胞的盘子。取出介质并将其丢弃在专用漂白剂废瓶中。
要清洗细胞，在板的一侧添加三毫升的冷PBS滴滴，以避免分离转染细胞。轻轻旋转板，将缓冲液铺到表面上。倾斜板以取出 PBS 并将其丢弃到废瓶中。
重复一次洗涤。将盘子放在冰上。最后，小心地拆下 PBS 的其余部分。
接下来，在转染洗涤细胞中加入500微升的冷解缓冲液。摊在盘子表面。在冰上孵育10分钟。
不时地将缓冲液铺在板面上。之后，使用细胞铲刮掉表面的细胞，并在微离心管中收集。在10，000倍的G和4摄氏度下进行10分钟的离心机。
将上流液酸盐收集到新的微离心管中，并收集该分数的 50 微升等分，再收集另一个新的微离心管。此等分物将用于检查转染蛋白是否表达良好。将颗粒丢弃在垃圾桶中。
首先，轻轻重新暂停与适当抗体相结合的阿加罗斯珠的库存溶液。切开 200 微升尖端的端，使开口 1 到 2 毫米。将尖端连接到微管，并绘制 40 微升溶液，让珠子进入尖端。
向上和向下移液珠数次，使珠子饱和，以确保珠子的正确体积，并转移珠子到微离心管。加入500微升TNET缓冲液，通过反转混合，在1000倍的G和4摄氏度下离心两分钟。小心地取出上流液，并添加 500 微升的 TNET 缓冲液。
在旋转轮上孵育至少一小时，温度为4摄氏度。然后，在1000倍的G和4摄氏度下将管子离心两分钟，然后用500微升的解液缓冲液通过倒置和离心两次清洗珠子。洗涤后，将先前收集的总馏分将酸盐放入管中，并在四摄氏度的旋转轮上孵育两到四个小时。
现在，在1000倍的G和4摄氏度下，将含有免疫沉淀珠的管子离心两分钟。通过倒置和离心，用500微升的解解缓冲液洗涤珠子五次。清洗珠子时，注意不要离珠子太近，同时去除上一液。
否则，珠子将被吸气，在实验结束时，将没有更多的珠子。对于洗脱，第一台离心机在1000度G和4摄氏度下进行两分钟的离心机。使用一毫升微管小心地取出上一液。
然后，用装有水泥针的汉密尔顿注射器，取出上一滴，以避免珠子吸入。接下来，添加 40 微升 4X Laemmli 缓冲液。轻轻敲击管子，使其均匀。
在室温下孵育五分钟。然后，在10，000倍的G和室温下进行5分钟的离心机。使用汉密尔顿注射器，将上流水液转移到新的微离心管中。
储存在零下80摄氏度。HEK-293 细胞被未标记的 LIMK 2-1 或 LIMK 2 的 HA 标记等构形式之一转染。LIMK 2-1 在不同的条件下表达良好。
抗 LIMK 2-1 抗体不识别 LIMK 2a 和 LIMK 2b 等构形式，并且是特异性的，因为与控制小干扰RNA相比，当细胞与 LIMK2 小干扰RNA进行转染时，其信号会降低。在各种人类细胞系中，LIMK 2-1似乎在 HEK-293 和 HeLa 中表达，但在 C6 中不表达。利用共生沉淀实验评估LIMK2-1与上游激酶岩石的相互作用。通过转染载体编码的每个不同的蛋白质都表达得很好。
LIMK2 的三个等同形式以及幼虫 6 被有效免疫沉淀。在水线中，检测到 ROCK，因此与 LIMK2 的三个等构形式共生，但与 larp6 不一起沉淀。然后检测到的交互是特定的。
通过伽玛P32 ATP标签测试了共生素LIMK 2-1的激酶活性。LIMK 2-1没有磷酸酯共生素，而它做磷酸化米林基本蛋白，或MBP。LIMK 2-1 在此测试中有效免疫沉淀。
在进行免疫沉淀时进行负控制至关重要，以确保相互作用是特定的。必须仔细设置解液缓冲液的组成，以保持相互作用和活动。在免疫沉淀时，可评估激酶活性以计算不同的基质。
突变可能很容易引入，并可能解开特定残留物的作用。也可以进行功能研究，以了解新的突出相互作用的生理作用。细胞必须在生物安全柜内的专用培养室中培养。
P32 ATP 必须谨慎处理。防护罩可防止辐射、盖革计数器、特定废物收集、个人乳房和手指徽章，以检测放射性暴露和过滤提示。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
