Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays
Chapters
Summary October 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.
Transcript
NAPPA is een krachtig eiwitmicroarrayplatform dat kan worden gebruikt voor de studie van eiwitactiviteit en functie op een onbevooroordeelde hoge doorvoerwijze. De eiwitten die op NAPPA worden weergegeven, worden geproduceerd in een menselijk expressiesysteem met menselijke afgeleide ribosomen en chaperonnes om de kans op natuurlijke vouwen en activiteit te verbeteren. Het gebruik van NAPPA-arrays voor de screening van kinaseremmers biedt een nieuw platform voor de test van nieuwe geneesmiddelen en klinisch relevante kinasemutaties.
Eiwitmicroarrays gegenereerd door NAPPA-methodologie kan worden gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarkerdetectie, eiwit-eiwitinteracties, substraatidentificatie en geneesmiddelenscreening. Voer onderweg stappen voor kwaliteitscontrole uit. Test de kwaliteit van je DNA-preparaat, de DNA-microarray en de eiwitmicroarray.
Als in een stap de kwaliteit niet goed is, gewoon opnieuw beginnen. Het aantonen van de procedure zal Lisa Miller zijn, een technicus in mijn laboratorium. Ter voorbereiding van bacteriële groei voor in huis hoge doorvoer mini-prep, eerst inenten de bacteriën in de vijzel plaat in een 96 goed formaat, en laat het groeien voor 16 uur.
Vul de volgende dag elke put van de diepe putplaat met 1,5 milliliter geweldig bouillonmedium, aangevuld met antilichaamampicilline. Het antilichaam is afhankelijk van de selectiemarker op de plasmide. Steriliseer vervolgens een 96-pins apparaat met 80% ethanol en vlam.
Gebruik het steriele 96-pins apparaat om kolonies te plukken van de 's nachts geïncubeerde agarplaat en onderdompel in de putten van de diepe putplaat om de cultuur in te enten. Bedek het blok met een gas-permeabele afdichting en incubeer op een shaker voor 22 tot 24 uur bij 37 graden Celsius, en 300 tot 800 rpm. Daarna, pellet culturen en resuspend de culturen volgens het manuscript.
Lyse bacteriën door het toevoegen van 200 microliters van oplossing twee in elke put, verzegelen de plaat met een aluminium afdichting, en omkeren vijf keer. De cellen precies vijf minuten uitbroeden. Om de oplossing te neutraliseren, voeg 200 microliter van oplossing drie, verzegel de plaat met een aluminium afdichting en omkeren vijf keer.
Draai vervolgens de plaat op 3800 G, vier graden Celsius, gedurende 30 minuten om het lysaat supernatant te wissen. Om anion uitwisseling hars platen voor te bereiden, eerst, meng de anion uitwisseling drijfmest, en giet de drijfmest in een glazen trog. Stapel filterplaten op een diepe putplaat om als afvalinzamelvat op te treden.
Vervolgens, met behulp van breed karton P1000 tips, meng de drijfmest, en breng 450 microliter van de drijfmest in elke put van de filterplaten. Centrifugeren en gooi de doorstroom weg. Nu, breng de lysate supernatants naar de stapel hars plaat en diepe put blok.
Draai de gestapelde platen gedurende vijf minuten op 30 keer G met langzaamste opritsnelheid en gooi de flow-through weg. Om de kolom te wassen, voeg 400 microliters van oplossing N3 wasbuffer aan elke put. Breng de harsplaat over op vacuümspruitstuk om de wasbuffer te verwijderen.
Herhaal de wasstap drie keer en verwijder vervolgens de resterende wasmachinebuffer met een korte vijf minuten spin op 30 keer G.To het DNA te verwijderen, plaats de harsplaat op een schone 800 microliter verzamelplaat. Voeg 300 microliter oplossing N5 toe aan elke put en laat het tien minuten op kamertemperatuur zitten. Draai vervolgens vijf minuten lang de gestapelde platen op 20 keer G met een langzame opritsnelheid tot 233 keer G gedurende een minuut.
Bewaar platen op negatieve 20 graden Celsius voorafgaand aan gebruik. Plaats eerst de glijbanen op een rek en dompel de dia's onder in een glazen reservoir met de coatingoplossing van 2%aminosilane reagens in aceton. Rock de glijbanen gedurende 15 minuten.
Spoel vervolgens de glijbanen in aceton, gevolgd door een laatste spoeling in water. Droog vervolgens de glijbanen met druklucht. Blazen op hen uit alle hoeken voor ongeveer drie minuten totdat alle waterdruppels zijn verwijderd.
Bewaar de gecoate glijbanen op kamertemperatuur op een metalen rek in een goed afgesloten doos. Nu, ga verder met het neerslaan van het DNA zoals beschreven in het manuscript. Dan, resuspend de DNA-pellet in 20 microliters van ultrazuiver water en schudden bij 1000 rpm gedurende twee uur.
Om arraymonsters voor te bereiden, voeg je 10 microliters vers bereide drukmix toe die het antilichaam, crosslinker en polylysine aan elk DNA-monster bevat. Verzegel platen met aluminiumfolie en schud bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten bij 1000 rpm. Bewaar de platen 's nachts op vier graden Celsius.
Op de drukdag, kort vortex en draai de platen. Breng 28 microliter van elk monster over naar een 384 putplaat. Plaats de aminosilane gecoate glijbanen en de 384 putplaat, op het arrayerdek, en start het microarray printprogramma.
Wanneer het afdrukken is gedaan, etiketteert u de microarrays. De microarrays kunnen maanden worden bewaard tot verder gebruik. Om de niveaus van DNA te meten, plaats de dia's in een pipetdoos en blokkeer ze met 50 milliliter blokkeerbuffer.
Broed de glijbanen op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende een uur. Gooi vervolgens de oplossing weg en voeg 20 milliliter blokkeerbuffer en 33 microliter fluorescerende DNA-intercalating kleurstof toe. Incubeer gedurende 15 minuten met agitatie.
Na de incubatie is voorbij, snel spoelen de glijbanen met ultra zuiver water en droog met druklucht. De microarrays zijn klaar om gescand te worden. Om de microarrays uit te drukken, blokkeer je de dia's zoals eerder getoond en spoel ze vervolgens af met ultra zuiver water en droog je met gefilterde perslucht.
Bevestig een afdichtingspakking aan elke glijbaan. Voeg 130 milliliter in vitro transcriptie en vertaling mix op de dia's, en zachtjes masseren de afdichting pakkingen, zodat de in vitro transcriptie en vertaling mix verspreidt zich en bestrijkt het hele gebied van de array zonder bubbels. Breng de kleine ronde poortafdichtingen aan op beide poorten.
Incubeer gedurende 90 minuten bij 30 graden Celsius voor eiwitexpressie, gevolgd door 30 minuten bij 15 graden Celsius voor immobilisatie van het query-eiwit. Verwijder vervolgens de pakking, was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten elk in 15 milliliter TBST met melk, en blok in dezelfde oplossing voor een uur. Voor de detectie van de eiwitten op de array, verwijder de TBST met melk, plaats de dia's op een roosterplaat en breng 600 microliter van primair antilichaam, muisanti-vlag, verdund een tot tweehonderd, en 1x TBST aangevuld met 5% melk.
Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur. Was de glijbanen met 50 milliliter 1x TBST en 5% melk op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten per stuk. Herhaal de procedure voor het secundaire antilichaam.
Na de een uur incubatie is voorbij, was de dia's met 1x TBST op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk. Spoel vervolgens snel de glijbanen af met ultra zuiver water en droog met druklucht. De dia's zijn klaar om te worden gescand.
Om de fosfatase en DNase behandeling uit te voeren, was en blokkeer de uitgedrukte dia's met TBST aangevuld met 3%BSA zoals beschreven in het manuscript. Plaats vervolgens de glijbanen op een rasterplaat en breng 200 microliter van fosfatase DNase-oplossing aan. Plaats een microarray cover slip op de top om verdamping te voorkomen.
Incubeer op 30 graden Celsius gedurende een uur en 30 minuten in de oven. Dan, was glijbanen met 1x TBST en 0,2 molaire natriumchloride op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk. Om de behandeling van het geneesmiddel en kinasereactie uit te voeren, plaatst u de dia's op de rasterplaat en past u 200 microliters van de kinaseoplossing van geneesmiddelen aan.
Plaats een cover slip op de top om verdamping te voorkomen. Een uur lang uitbroeden bij 30 graden Celsius in de oven. De sleutel tot reproduceerbare gegevens is consistente incubatietijd tussen dia's.
Dit is vooral belangrijk tijdens de kinase reactie. De tijd die nodig is om elke dia te verwerken, moet worden verantwoord. Daarna, wasg glijbanen met 1x TBST en 0,2 molaire natriumchloride op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk.
Herhaal eiwitdetectie met als primair antilichaam fosfotyrosineantilichaam verdund een tot 100 in TBST, aangevuld met 3%runderserum albumine. Gebruik 1x TBST en 3% runderserum albumine voor het wassen na de incubatie met primair antilichaam, en TBST voor wasbeurten na incubaties met secundair antilichaam. Wassen en drogen zoals voorheen.
Laad de microarrays in het diahouderblad voor het verwerven van afbeeldingen. Laad het magazijn in de microarray scanner. Scan alle microarrays met de geoptimaliseerde instellingen en vergeet niet om de automatische winst uit te schakelen bij het vergelijken van afbeeldingen over experimenten.
Breng de beelden over naar een kwantificeringssoftware, lijn het raster uit met de vlekken en kwantificeer de signaalintensiteit van elke functie op de microarray. Ga verder met statistische analyse. In deze studie toonde de microarray de meeste vlekken die complementair DNA bevatten met succes detecteerbare niveaus van eiwitten.
NAPPA kinase microarrays toonde een goede reproduceerbaarheid onder dia's, met de correlatie van de niveaus van eiwit weer te geven tussen verschillende printpartijen hoger dan 0,88. Representatieve resultaten van kinaseactiviteit in NAPPA kinase arrays toonden een hoog niveau van eiwitfos fosforylatie na expressie. De vergelijking tussen microarrays waarbij de fosforylatieniveaus direct na de behandeling met fosfatase werden gemeten en na 60 minuten autofosfoloatiereactie, suggereert de aanwezigheid van actieve eiwitkinasen op de array.
Op NAPPA kinase arrays vertoonde imatinib een aanzienlijke daling van de ABL1- en BCR-ABL1-activiteit, terwijl andere kinases meestal onaangetast bleven. De kinaseactiviteit normaliseerde tegen de dephosphorylated array en vertegenwoordigde als een percentage van de positieve controlemicroarray toonde selectieve remming van imatinib naar ABL1 en BCR-ABL1. Typische resultaten verkregen voor de ibrutinib screening toonde de kinase activiteit van ABL1 niet-relevante kinase is onaangetast.
BTK canonieke doelstelling, en ERBB4 potentiële nieuwe doelstelling, Toonde verminderde activiteit in de aanwezigheid van ibrutinib. De gegevens suggereren ERBB4 kan worden geremd door ibrutinib in een dosis-specifieke manier. Het succes van eiwitmicroarray screenings zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de microarray zelf.
Verschillende positieve en negatieve controlefuncties moeten worden gebruikt om een goede gegevensanalyse mogelijk te maken. NAPPA kinase test is een screening platform, en als zodanig, de verkregen gegevens moeten worden gevalideerd in follow-up testen, die kunnen omvatten in vitro kinase testen, of cel gebaseerde tests. Aangezien ons protocol begint met cDNA, kan elke kinase mutatie of variatie gemakkelijk worden opgenomen in de microarray en bestudeerd in hoge doorvoer.
Tijdens de voorbereiding van de anionuitwisselingsdrijfmest en platen wordt aanbevolen maskers te gebruiken om mogelijke inademing van de harsdeeltjes te voorkomen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
