Biochemistry
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Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés
Chapters
Summary October 23rd, 2019
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Un protocole détaillé pour la génération de microarrays de protéines humaines auto-assemblés pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase est présenté.
Transcript
NAPPA est une puissante plate-forme de microrésoration protéique qui peut être utilisée pour l’étude de l’activité et de la fonction protéiques d’une manière impartiale à haut débit. Les protéines affichées sur NAPPA sont produites dans un système d’expression à base humaine utilisant des ribosomes et chaperons d’origine humaine afin d’améliorer la probabilité de pliage et d’activité naturels. L’utilisation de tableaux NAPPA pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase fournit une nouvelle plate-forme pour l’essai de nouveaux médicaments et de mutations kinase cliniquement pertinentes.
Les microrésiteurs protéiques générés par la méthodologie NAPPA peuvent être utilisés pour de nombreuses applications distinctes, y compris la découverte de biomarqueurs, les interactions protéines-protéines, l’identification du substrat et le dépistage des médicaments. Effectuez des étapes de contrôle de la qualité en cours de route. Testez la qualité de votre préparation d’ADN, le microrése d’ADN et le microrésitent protéique.
Si dans n’importe quelle étape la qualité n’est pas bonne, il suffit de recommencer. Lisa Miller, technicienne dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour préparer la croissance bactérienne dans la maison à haut débit mini-préparation, d’abord inoculer les bactéries dans la plaque d’auger dans un format de puits 96, et laisser croître pendant 16 heures.
Le lendemain, remplissez chaque puits de la plaque de puits profond avec 1,5 millilitres de bouillon terrible moyen, complété par de l’ampicilline d’anticorps. L’anticorps dépend du marqueur de sélection du plasmide. Ensuite, stérilisez un dispositif de 96 broches avec 80% d’éthanol et de flamme.
Utilisez le dispositif stérile de 96 broches pour ramasser les colonies de la plaque d’agar incubée pendant la nuit et plonger dans les puits de la plaque profonde du puits pour inoculer la culture. Couvrir le bloc d’un joint perméable au gaz et incuber sur un shaker pendant 22 à 24 heures à 37 degrés Celsius, et 300 à 800 rpm. Après cela, les cultures de granulés et de réutiliser les cultures selon le manuscrit.
Bactéries Lyse en ajoutant 200 microlitres de solution deux dans chaque puits, sceller la plaque avec un joint en aluminium, et inverser cinq fois. Incuber les cellules pendant exactement cinq minutes. Pour neutraliser la solution, ajouter 200 microlitres de solution trois, sceller la plaque avec un joint en aluminium et inverser cinq fois.
Ensuite, faites tourner la plaque à 3800 G, quatre degrés Celsius, pendant 30 minutes pour dégager le supernatant lysate. Pour préparer des plaques de résine d’échange d’anion, d’abord, mélanger le lisier d’échange d’anion, et verser le lisier dans une auge en verre. Empilez les plaques de filtre sur une plaque de puits profonde pour agir comme un récipient de collecte des déchets.
Ensuite, à l’aide de larges pointes P1000, mélanger le lisier, et transférer 450 microlitres de la boue dans chaque puits des plaques de filtre. Centrifugeuse et jeter le flux à travers. Maintenant, transférez les supernatants lysate à la pile de plaque de résine et de bloc de puits profond.
Faites tourner les plaques empilées pendant cinq minutes à 30 fois G avec la vitesse de montée en puissance la plus lente et jetez le flux à travers. Pour laver la colonne, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage N3 solution à chaque puits. Transférer la plaque de résine dans le collecteur sous vide pour enlever le tampon de lavage.
Répétez l’étape de lavage trois fois, puis retirez tout tampon de lave-linge restant avec une brève rotation de cinq minutes à 30 fois G.To élisez l’ADN, placez la plaque de résine sur une plaque de collecte propre de 800 microlitres. Ajouter 300 microlitres de solution N5 à chaque puits et laisser reposer à température ambiante pendant dix minutes. Ensuite, faites tourner les plaques empilées pendant cinq minutes à 20 fois G avec une vitesse de montée en puissance lente à 233 fois G pendant une minute.
Conservez les assiettes à 20 degrés Celsius négatifs avant de les utiliser. Tout d’abord, placez les glissières sur une grille et submergez les glissières dans un réservoir de verre contenant la solution de revêtement de 2 % de réacétone d’aminosilane. Faire basculer les toboggans pendant 15 minutes.
Rincez ensuite les diapositives à l’acétone suivies d’un rinçage final à l’eau. Ensuite, séchez les glissières à l’aide d’air sous pression. Soufflant sur eux sous tous les angles pendant environ trois minutes jusqu’à ce que toutes les gouttelettes d’eau ont été enlevés.
Conservez les glissières enduites à température ambiante sur une grille métallique à l’intérieur d’une boîte hermétiquement scellée. Maintenant, procédez à précipiter l’ADN tel que décrit dans le manuscrit. Puis, résuspendez la pastille d’ADN dans 20 microlitres d’eau ultrapure et secouez à 1000 rpm pendant deux heures.
Pour préparer l’échantillon de tableau, ajoutez 10 microlitres de mélange d’impression fraîchement préparé qui contient l’anticorps, le crosslinker, et la polylysine à chaque échantillon d’ADN. Sceller les plaques avec du papier d’aluminium et agiter à température ambiante pendant 90 minutes à 1000 rpm. Conserver les assiettes toute la nuit à quatre degrés Celsius.
Le jour de l’impression, brièvement vortex et tourner les plaques. Transférer 28 microlitres de chaque échantillon dans une plaque de puits 384. Placez les glissières enduites d’aminosilane et la plaque de puits 384, sur le pont du tableau de bord, et commencez le programme d’impression de microréseau.
Lorsque l’impression est terminée, étiquetez les microarrays. Les microarrays peuvent être stockés pendant des mois jusqu’à nouvel usage. Pour mesurer les niveaux d’ADN, placez les glissières dans une boîte de pipette et bloquez-les avec 50 millilitres de tampon de blocage.
Incuber les glissières sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Ensuite, jetez la solution et ajoutez 20 millilitres de tampon bloquant et 33 microlitres de colorant intercalaire d’ADN fluorescent. Incuber pendant 15 minutes avec agitation.
Une fois l’incubation terminée, rincez rapidement les glissières à l’eau ultra pure et séchez-les à l’air comprimé. Les microarrays sont prêts à être scannés. Pour exprimer les microarrays, bloquez les glissières comme indiqué précédemment, puis rincez-les à l’eau ultra pure, et séchez-les à l’air comprimé filtré.
Fixez un joint d’étanchéité à chaque glissière. Ajouter 130 millilitres de transcription in vitro et de mélange de traduction sur les diapositives, et masser doucement les joints d’étanchéité de sorte que le mélange de transcription in vitro et de traduction s’étend et couvre toute la zone du tableau sans bulles. Appliquer les petits joints de port ronds sur les deux ports.
Incuber pendant 90 minutes à 30 degrés Celsius pour l’expression des protéines, suivi de 30 minutes à 15 degrés Celsius pour l’immobilisation de la protéine de requête. Ensuite, retirez le joint, lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes chacune en 15 millilitres TBST avec du lait, et bloquez dans la même solution pendant une heure. Pour la détection des protéines sur le tableau, retirer le TBST avec du lait, placer les diapositives sur une plaque de grille, et appliquer 600 microlitres d’anticorps primaires, anti-drapeau de souris, dilué un à deux cents, et 1x TBST complété avec 5% de lait.
Incuber pendant une heure à température ambiante. Lavez les toboggans avec 50 millilitres de 1x TBST et 5% de lait sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Répétez la procédure pour l’anticorps secondaire.
Une fois l’incubation d’une heure terminée, laver les toboggans avec 1x TBST sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Rincez ensuite rapidement les glissières à l’eau ultra pure et séchez à l’aide d’air sous pression. Les diapositives sont prêtes à être numérisées.
Pour effectuer le traitement à la phosphatase et au DNase, lavez et bloquez les diapositives exprimées avec tbst complétées par 3%BSA tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, placez les glissières sur une plaque de grille et appliquez 200 microlitres de solution phosphatase DNase. Placez un slip de couverture de microarray sur le dessus pour éviter l’évaporation.
Incuber à 30 degrés Celsius pendant une heure et 30 minutes au four. Ensuite, lavez les diapositives avec 1x TBST et 0,2 chlorure de sodium molaire sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Pour effectuer le traitement médicamenteux et la réaction de kinase, placez les glissières sur la plaque de grille et appliquez 200 microlitres de solution de kinase de drogue.
Placez un glissement de couvercle sur le dessus pour éviter l’évaporation. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius dans le four. La clé des données reproductibles est le temps d’incubation constant entre les diapositives.
Ceci particulièrement important pendant la réaction de kinase. Le temps nécessaire pour traiter chaque diapositive doit être pris en compte. Après cela, laver les diapositives avec 1x TBST et 0,2 chlorure de sodium molaire sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun.
Répéter la détection des protéines à l’aide d’anticorps primaires phosphotyrosine anticorps dilué un à 100 dans TBST, complétée par 3% d’albumine de sérum bovine. Utilisez 1x TBST et 3% d’albumine de sérum bovin pour le lavage après l’incubation avec l’anticorps primaire, et TBST pour les lavages après incubations avec des anticorps secondaires. Laver et sécher comme auparavant.
Pour l’acquisition d’images, chargez les microarrays dans le chargeur de support de diapositives. Chargez le chargeur dans le scanner microarray. Scannez tous les microarrays avec les paramètres optimisés et n’oubliez pas d’éteindre le gain automatique lorsque vous comparez des images à travers des expériences.
Transférez les images vers un logiciel de quantification, alignez la grille avec les taches et quantifiez l’intensité du signal de chaque entité sur le microrése. Procéder à l’analyse statistique. Dans cette étude, le microarray a montré la majorité des taches contenant l’ADN complémentaire avec succès montré des niveaux détectables de protéine.
Nappa kinase microarrays a montré une bonne reproductibilité parmi les diapositives, avec la corrélation des niveaux d’affichage des protéines entre les lots d’impression distincts supérieurs à 0,88. Les résultats représentatifs de l’activité de kinase dans les tableaux de kinase de NAPPA ont montré des niveaux élevés de phosphorylation de protéine après expression. La comparaison entre les microrésaires dans lesquels les niveaux de phosphorylation ont été mesurés juste après le traitement de phosphatase, et après 60 minutes de réaction d’autophosphorylation, suggère la présence des kinases actives de protéine sur le tableau.
Sur les tableaux de kinase nappa, l’imatinib a montré une réduction significative de l’activité ABL1 et BCR-ABL1, tandis que d’autres kinases sont restées la plupart du temps inchangées. L’activité de kinase normalisée contre le tableau déphosphorylated et représentée en pourcentage du microarray positif de contrôle a montré l’inhibition sélective de l’imatinib vers ABL1 et BCR-ABL1. Les résultats typiques obtenus pour le criblage d’ibrutinib ont montré que l’activité de kinase de kinase d’ABL1 kinase non-pertinente n’est pas affectée.
BTK cible canonique, et ERBB4 nouvelle cible potentielle, a montré une activité réduite en présence d’ibrutinib. Les données suggèrent qu’ERBB4 peut être inhibé par l’ibrutinib d’une manière spécifique à la dose. Le succès des criblages de microrésaires protéiques dépend fortement de la qualité du microrésaire lui-même.
Plusieurs caractéristiques de contrôle positives et négatives devraient être utilisées pour permettre une analyse appropriée des données. Nappa kinase test est une plate-forme de dépistage, et en tant que tel, les données obtenues doivent être validées dans les tests de suivi, qui peuvent inclure des analyses de kinase in vitro, ou des analyses à base de cellules. Puisque notre protocole commence avec cDNA, n’importe quelle mutation ou variation de kinase peut être facilement incorporée dans le microarray et étudiée dans le haut débit.
Pendant la préparation de la boue et des plaques de résine d’échange d’anion, il est recommandé d’utiliser des masques pour empêcher l’inhalation possible des particules de résine.
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