Biochemistry
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Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati
Chapters
Summary October 23rd, 2019
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Viene presentato un protocollo dettagliato per la generazione di microarray proteici umani auto-assemblati per lo screening degli inibitori della chinasi.
Transcript
NAPPA è una potente piattaforma di microarray proteico che può essere utilizzata per lo studio dell'attività e della funzione proteica in modo imparziale ad alta produttività. Le proteine esposte sul NAPPA sono prodotte in un sistema di espressione a base umana utilizzando ribosomi e chaperones derivati dall'uomo al fine di migliorare la probabilità di piegatura e attività naturali. L'uso di array NAPPA per lo screening degli inibitori della chinasi fornisce una nuova piattaforma per il test di nuovi farmaci e mutazioni della chinasi clinicamente rilevanti.
I microarray proteici generati dalla metodologia NAPPA possono essere utilizzati per molte applicazioni distinte, tra cui la scoperta di biomarcatori, interazioni proteina-proteina, identificazione del substrato e screening farmacologico. Eseguire passaggi di controllo qualità lungo il percorso. Prova la qualità della preparazione del DNA, il microarray di DNA e il microarray proteico.
Se in qualche passo la qualità non è buona, ricominciare da capo. A dimostrare la procedura sarà Lisa Miller, un tecnico del mio laboratorio. Per preparare la crescita batterica per la mini-preparazione ad alta produttività in casa, inoculare prima i batteri nella piastra della coclea in un formato di pozzo 96 e lasciarla crescere per 16 ore.
Il giorno dopo, riempire ogni pozzo della piastra del pozzo profondo con 1,5 millilitri di formidabile mezzo brodo, integrato con ampicillina anticorpale. L'anticorpo dipende dal marcatore di selezione sul plasmide. Quindi, sterilizzare un dispositivo a 96 pin con 80% di etanolo e fiamma.
Utilizzare il dispositivo sterile a 96 pin per raccogliere le colonie dalla piastra di agar incubata durante la notte e immergersi nei pozzi della piastra del pozzo profondo per inoculare la coltura. Coprire il blocco con una guarnizione permeabile al gas e incubare su uno shaker per 22-24 ore a 37 gradi Celsius e da 300 a 800 giri/min. Successivamente, le colture di pellet e rimovano le colture secondo il manoscritto.
Batteri lyse aggiungendo 200 microlitri di soluzione due in ogni pozzo, sigillare la piastra con una guarnizione in alluminio e invertire cinque volte. Incubare le cellule per esattamente cinque minuti. Per neutralizzare la soluzione, aggiungere 200 microlitri della soluzione tre, sigillare la piastra con una guarnizione in alluminio e invertire cinque volte.
Quindi, ruotare la piastra a 3800 G, quattro gradi Celsius, per 30 minuti per cancellare il supernatante lisato. Per preparare le lastre di resina a scambio di anione, in primo luogo, mescolare il liquame di scambio di anione e versare il liquame in un trogolo di vetro. Impilare le piastre filtranti sopra una piastra profonda per fungere da recipiente per la raccolta dei rifiuti.
Quindi, utilizzando punte P1000 a scheda larga, mescolare il liquame e trasferire 450 microlitri del liquame in ogni pozzo delle piastre filtranti. Centrifugare e scartare il flusso. Ora, trasferire i supernatanti di lysate nella pila di piastra di resina e nel blocco profondo del pozzo.
Ruotare le piastre impilate per cinque minuti a 30 volte G con la velocità di rampa più lenta e scartare il flusso. Per lavare la colonna, aggiungere 400 microlitri della soluzione N3 tampone di lavaggio ad ogni pozzo. Trasferire la piastra di resina nel collettore sottovuoto per rimuovere il tampone di lavaggio.
Ripetere la fase di lavaggio tre volte e quindi rimuovere il tampone della lavatrice rimanente con un breve giro di cinque minuti a 30 volte G.To elute il DNA, posizionare la piastra di resina su una piastra di raccolta pulita di 800 microlitri. Aggiungere 300 microlitri di soluzione N5 ad ogni pozzo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per dieci minuti. Quindi, ruotare le piastre impilate per cinque minuti a 20 volte G con una velocità di rampa lenta fino a 233 volte G per un minuto.
Conservare le lastre a -20 gradi Celsius prima dell'uso. In primo luogo, posizionare gli scivoli su un rack e immergere gli scivoli in un serbatoio di vetro contenente la soluzione di rivestimento del reagente al 2%amminosilano in acetone. Dondolare gli scivoli per 15 minuti.
Quindi, sciacquare gli scivoli in acetone seguito da un risciacquo finale in acqua. Quindi, asciugare i vetrini utilizzando aria sotto pressione. Soffiare su di loro da tutte le angolazioni per circa tre minuti fino a quando tutte le goccioline d'acqua sono state rimosse.
Conservare gli scivoli rivestiti a temperatura ambiente su un rack metallico all'interno di una scatola ben sigillata. Ora, procedete a far precipitare il DNA come descritto nel manoscritto. Quindi, rimescolare il pellet di DNA in 20 microlitri di acqua ultrapura e agitare a 1000 giri/min per due ore.
Per preparare il campione di array, aggiungere 10 microlitri di miscela di stampa appena preparata che contiene l'anticorpo, il reticolo e la polilisina a ciascun campione di DNA. Sigillare le piastre con un foglio di alluminio e agitare a temperatura ambiente per 90 minuti a 1000 giri/min. Conservare i piatti durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno della stampa, vortice brevemente e girare le piastre. Trasferire 28 microlitri di ciascun campione su una piastra da 384 pozza. Posizionare le diapositive rivestite con amminosilano e la piastra del pozzo 384, sul ponte dell'arrayer, e avviare il programma di stampa microarray.
Al termine della stampa, etichettare i microarray. I microarray possono essere conservati per mesi fino a un ulteriore utilizzo. Per misurare i livelli di DNA, posizionare le diapositive in una scatola di pipetta e bloccarle con 50 millilitri di tampone di blocco.
Incubare gli scivoli su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, scartare la soluzione e aggiungere 20 millilitri di tampone di blocco e 33 microlitri di colorante intercalante fluorescente del DNA. Incubare per 15 minuti con agitazione.
Al termine dell'incubazione, sciacquare rapidamente gli scivoli con acqua ultra pura e asciugare con aria a pressione. I microarray sono pronti per essere scansionati. Per esprimere i microarray, bloccare le diapositive come mostrato in precedenza e quindi risciacquarle con acqua ultra pura e asciugare con aria compressa filtrata.
Attaccare una guarnizione di tenuta a ogni diapositiva. Aggiungere 130 millilitri di trascrizione e traduzione in vitro mescolare sulle diapositive e massaggiare delicatamente le guarnizioni di tenuta in modo che il mix di trascrizione e traduzione in vitro si diffonda e copra l'intera area dell'array senza bolle. Applicare le piccole guarnizioni rotonde delle porte su entrambe le porte.
Incubare per 90 minuti a 30 gradi Celsius per l'espressione proteica, seguita da 30 minuti a 15 gradi Celsius per l'immobilizzazione della proteina di query. Quindi, rimuovere la guarnizione, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti ciascuno in 15 millilitri TBST con latte e bloccare nella stessa soluzione per un'ora. Per il rilevamento delle proteine sull'array, rimuovere il TBST con il latte, posizionare le diapositive su una piastra della griglia e applicare 600 microlitri di anticorpo primario, mouse anti-Flag, diluito da uno a duecento e 1x TBST integrato con il 5% di latte.
Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli con 50 millilitri di 1 tbst e 5% di latte sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Ripetere la procedura per l'anticorpo secondario.
Al termine dell'incubazione di un'ora, lavare gli scivoli con 1 TBST sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Quindi, sciacquare rapidamente gli scivoli con acqua ultra pura e asciugare con aria a pressione. Le diapositive sono pronte per essere scansionate.
Per eseguire il trattamento con fosfatasi e DNasi, lavare e bloccare le diapositive espresse con TBST integrate con il 3%BSA come descritto nel manoscritto. Quindi, posizionare le diapositive su una piastra a griglia e applicare 200 microlitri di soluzione di DNasi fosfatasi. Posizionare un coperchio del microarray in cima per evitare l'evaporazione.
Incubare a 30 gradi Celsius per un'ora e 30 minuti in forno. Quindi, lavare gli scivoli con 1 TBST e 0,2 cloruro di sodio molare sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno. Per eseguire il trattamento farmacologico e la reazione chinasi, posizionare le diapositive sulla piastra della griglia e applicare 200 microlitri di soluzione di chinasi farmacologica.
Posizionare un coperchio in cima per evitare l'evaporazione. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius nel forno. La chiave per i dati riproducibili è il tempo di incubazione coerente tra le diapositive.
Questo è particolarmente importante durante la reazione della chinasi. Il tempo necessario per elaborare ogni diapositiva deve essere tenuto in considerazione. Successivamente, lavare gli scivoli con 1 TBST e 0,2 cloruro di sodio molare sullo shaker a dondolo tre volte per cinque minuti ciascuno.
Ripetere il rilevamento delle proteine utilizzando come anticorpo fosfotirosina anticorpale primario diluito da uno a 100 in TBST, integrato con albumina siere bovina al 3%. Utilizzare 1x TBST e 3% di albumina di siero bovino per il lavaggio dopo l'incubazione con anticorpo primario e TBST per lavaggi dopo incubazioni con anticorpi secondari. Lavare e asciugare come in precedenza.
Per l'acquisizione di immagini, caricare i microarray nel caricatore porta diapositiva. Caricare il caricatore nello scanner microarray. Scansiona tutti i microarray con le impostazioni ottimizzate e ricorda di disattivare il guadagno automatico quando confronti le immagini tra gli esperimenti.
Trasferire le immagini in un software di quantificazione, allineare la griglia con i punti e quantificare l'intensità del segnale di ogni feature sul microarray. Procedere con l'analisi statistica. In questo studio, il microarray ha mostrato che la maggior parte delle macchie contenenti DNA complementare mostravano con successo livelli rilevabili di proteine.
I microarray di nappa chinasi hanno mostrato una buona riproducibilità tra le diapositive, con la correlazione dei livelli di esposizione proteica tra lotti di stampa distinti superiori a 0,88. Risultati rappresentativi dell'attività della chinasi negli array di NAPPA chinasi hanno mostrato alti livelli di fosforilazione proteica dopo l'espressione. Il confronto tra microarray in cui i livelli di fosforilazione sono stati misurati subito dopo il trattamento con fosfatasi, e dopo 60 minuti di reazione di autofosforilazione, suggerisce la presenza di chinasi proteiche attive sull'array.
Sugli array di nappa chinasi, l'imatinib ha mostrato una significativa riduzione dell'attività ABL1 e BCR-ABL1, mentre altre chinasi sono rimaste per lo più inaltenate. L'attività della chinasi normalizzata rispetto all'array defosforilato e rappresentata come percentuale del microarray di controllo positivo mostrò un'inibizione selettiva dell'imatinib verso ABL1 e BCR-ABL1. I risultati tipici ottenuti per lo screening ibrutinib hanno mostrato che l'attività della chinasi ABL1 non rilevante non è influenzata.
BTK obiettivo canonico, e ERBB4 potenziale nuovo obiettivo, Ha mostrato un'attività ridotta in presenza di ibrutinib. I dati suggeriscono che l'ERBB4 può essere inibito da ibrutinib in modo specifico per la dose. Il successo degli screening del microarray proteico dipende fortemente dalla qualità del microarray stesso.
Per consentire un'adeguata analisi dei dati, è necessario utilizzare diverse funzioni di controllo positive e negative. Il test della NAPPA chinasi è una piattaforma di screening e, in quanto tale, i dati ottenuti devono essere convalidati in saggi di follow-up, che possono includere saggi di chinasi in vitro o saggi basati su cellule. Poiché il nostro protocollo inizia con cDNA, qualsiasi mutazione o variazione della chinasi può essere facilmente incorporata nel microarray e studiata ad alta produttività.
Durante la preparazione del liquame e delle piastre in resina a scambio di anione, si raccomanda l'uso di maschere per prevenire la possibile inalazione delle particelle di resina.
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