Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken
Chapters
Summary August 12th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.
Transcript
DNA en RNA microarrays zijn zeer nuttig om de interacties tussen nucleïnezuren en eiwitten te bestuderen, maar ze zijn ook een handige methode voor de voorbereiding van sequentiebibliotheken. Fotolithografie maakt het mogelijk om honderdduizenden unieke sequenties parallel te synthetiseren en is momenteel de enige directe methode voor RNA-synthese op microarrays. De in situ fotolithografische synthese van microarrays kan ook worden uitgebreid tot chemisch gemodificeerde oligonucleotiden, bijvoorbeeld met twee priemfluor van peptide nucleïnezuren.
Het zien van het proces van microarray fabricage en handling kan helpen begrijpen hoe deze complexe machines is ontwikkeld op basis van de bekende standaard vaste fase DNA synthese. Begin deze procedure met microarray ontwerp en dia functionalisatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Zet de DNA synthesizer UV LED en de koelventilator aan.
Bevestig een UV-intensiteitsmeter op het brandpunt van binnenkomend UV-licht en zet deze aan. Start op de computer de WiCell Controller-software. Schakel het micromere-apparaat in en initialiseer deze.
Laad een volledig wit maskerbestand door met de rechtermuisknop op DMD te klikken en vervolgens de afbeelding laden te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op het UVS-pictogram en selecteer UV-sluiter open. Lees de vermogenswaarde op de intensiteitsmeter en tel 60 seconden.
Lees na 60 seconden de vermogenswaarde opnieuw en noteer de begin- en eindwaarden. Sluit de sluiter door UV-sluiter te selecteren dicht en schakel de intensiteitsmeter uit. Bereken de gemiddelde UV-intensiteit in milliwatt per vierkante centimeter.
Laad in de WiCell-software de taak-, sequentie- en protocolbestanden in hun respectievelijke subvensters en klik vervolgens op verzenden om de sequentie- en protocolbestanden naar de DNA-synthesizer te verzenden. Voor het monteren van de synthesecel plaatst u een dikke perfluoroelastomerpakking op het kwartsblok van de cel. Plaats vervolgens een geboorde, gefunctionaliseerde microscoopplaat bovenop de eerste pakking en controleer of de gaten op de glijbanen verbinding maken met de inlaat- en uitlaatbuizen van de synthesecel.
Plaats een tweede, dunne polytetrafluorethyleenpakking over de geboorde glijbaan, rond de twee gaten. Tot slot, plaats een tweede, gefunctionaliseerde maar ongeboorde dia bovenop de tweede pakking. Plaats nu een 4-schroef metalen frame op de top van de geassembleerde dubbele substraat cel Draai de schroef aan dezelfde klemkracht met behulp van een koppel schroevendraaier.
Bevestig de inlaat en uitlaatbuizen aan de DNA-synthesizer. Prime de acetonitrile waslijn en controleer de juiste stroom acetonitril door de substraten. Meet het volume acetonitril aan de afvallijn na zeven cycli acetonitrile priming.
Dit volume moet twee milliliter zijn. Bevestig de synthesecel aan het brandpuntsvlak van binnenkomend UV-licht. In het geval van bibliotheekvoorbereiding bevestigt u een extra inlaat- en uitlaatlijn aan de achterkant van de cel en vul de achterkamer met de twee milliliters van de betacaroteenoplossing.
Start de synthese door eerst te klikken op Draaien in de WiCell-software. Bij de eerste wachtopdracht in het taakbestand drukt u op start op de DNA-synthesizer. Na synthese van gewone microarrays, koppel de cel los van de synthesizer en demontage van de cel.
Gebruik een diamantpen om het synthesenummer op de glazen platen te etneren. Etch het nummer op de niet-gesynthetiseerde gezicht van elke dia. Breng de glijbanen in 50 milliliter centrifugebuizen en bewaar in een uitgedroogd gebied tot verder gebruik.
Na de synthese van bibliotheekmicroarrays, giet eerst de betacaroteenoplossing uit de kamer en was de kamer vervolgens twee maal door vijf milliliter methyleenchloride door te stromen voordat u aftaste. Voor DNA microarry deprotectie, vul een kleuring glazen pot met 20 milliliter ethanol en 20 milliliter EDA. Plaats de DNA-only microarrays verticaal in de pot, sluit het deksel en laat de dia's twee uur deprotecteren bij kamertemperatuur.
Haal na twee uur de glijbanen op met een pincet en spoel ze grondig af met dubbel gedestilleerd water. Droog de glijbanen in een microarray centrifuge voor een paar seconden voordat ze worden opgeslagen in een desiccator. Voor RNA microarray deprotectie, bereid een droge oplossing van 20 milliliter triethylamine en 30 milliliter acetonitril in een 50 milliliter centrifuge buis.
Breng een RNA microarray-dia in de centrifugebuis, sluit het deksel en wikkel met plastic afdichtingsfilm. Schud de centrifugebuis voorzichtig op een orbitale shaker gedurende een uur en 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de glijbaan en was twee keer met 20 milliliter droge acetonitrile voordat u een paar seconden in een microarraycentrifuge droogt.
Na de eerste deprotectiestap breng de RNA-schuif in de hydrazinehydreoplossing, sluit het deksel en wikkel met plastic afdichtingsfolie. Na twee uur zachtjes schudden op een orbitale shaker, verwijder de dia en was het twee keer met 20 milliliter droge acetonitril. Dan droog in een microarray centrifuge voor een paar seconden.
Als de RNA-microarray ook DNA-nucleotiden bevat, ga dan verder met een derde deprotectiestap. Voeg de DNA/RNA microarray toe aan een buis van 50 milliliter met een eda-ethanoloplossing Na 5 minuten bij kamertemperatuur, verwijder de glijbaan en was de microarray twee keer met 20 milliliter steriel water. Droog de glijbaan in een microarray centrifuge en bewaar in een desiccator.
Bereid in een 1,5 milliliter steriele microcentrifugebuis de hybridisatiebuffer met Cy3-gelabeld DNA voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng en vortex de oplossing. Plaats voorzichtig een zelfklevende 300 microliter hybridisatiekamer over het synthesegebied op elke glijbaan en pipet in de hybridisatieoplossing.
Bedek de gaten van de kamer met kleefpunten en wikkel de hele glijbaan in aluminiumfolie. Plaats de microarray schuif in de hybridisatie oven, dek af en laat het zachtjes draaien op de geselecteerde hybridisatie temperatuur gedurende twee uur. Na twee uur, los de glijbaan, verwijder de aluminiumfolie, pipette uit de hybridisatie oplossing, en voorzichtig scheuren uit de hybridisatiekamer.
Breng de glijbanen in een centrifugebuis met 30 milliliter niet-strenge wasbuffer. Schud twee minuten krachtig bij kamertemperatuur. Breng de glijbaan in een centrifugebuis met 30 milliliter Stringent Wash Buffer en schud krachtig gedurende een minuut.
Breng ten slotte de schuif over in een centrifugebuis met 30 milliliter Final Wash Buffer. Schud een paar seconden. Droog de glijbaan in een microarray centrifuge.
Plaats nu de droge microarray, synthese gebied naar beneden gericht, in de diahouder van de microarray scanner. Om DNA-bibliotheken te beschermen en te klemmen, dompel je de glijbaan onder in de decolletéoplossing, in een 50 milliliter centrifugebuis. Sluit de buis en wikkel met plastic afdichting film, voordat zachtjes draaien in een orbitale shaker gedurende twee uur op kamertemperatuur.
Na twee uur, verwijder de glijbaan en was twee keer met 20 milliliter van nauwgezet droge acetonitril voordat u het lucht drogen. Breng met een pipet 100 microliter steriel water aan boven het nu waarneembare synthesegebied. Pipet de oplossing op en neer een paar keer voor de overdracht van het in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.
Herhaal het proces en combineer de microarray eluaat in dezelfde buis. Verdamp de chip eluate tot droogte en vervolgens redissolve in 10 microliter van nuclease-vrije H2O. Hier zijn de resultaten van een hybridisatie test uitgevoerd op een microarray met de DNA en RNA versies van een 25mer sequentie.
De scan in verschijnt in een groenschaal formaat dat overeenkomt met de excitatie, emissiespectrum van Cy3 fluorescentie, met fluorescentie intensiteit geregistreerd in willekeurige eenheden. Er is aanzienlijke variabiliteit in absolute fluorescentiewaarden tussen experimenten. De resultaten voor drie onafhankelijke syntheses met dezelfde fabricageparameters en dezelfde postsynthetische behandeling worden weergegeven.
Het 25mer DNA, wanneer gehybridiseerd aan zijn aanvullende Cy3-geëtiketteerde bundel van het etiket, zal fluorescentiesignalen leveren die overal van 20. Het 25mer RNA, wanneer gehybridiseerd aan de zelfde Cy3-geëtiketteerde aanhang van DNA, zal fluorescentieintensiteiten op de overeenkomstige eigenschappen geven die zich van 15., 000 tot 20. Fluorescentieintensiteit van de RNA/DNA duplexen zal echter af en toe dalen tot onder de 8.000, wanneer de overeenkomstige DNA/DNA duplexen nog steeds zullen fluoresceren binnen het bereik van 20.000 tot 30.000.
In dergelijke gevallen kunnen de resultaten voor RNA als suboptimaal worden beschouwd. Zoals met elk ander RNA-gebaseerd experiment is het belangrijk om te onthouden dat RNA microarrays gevoelig zijn voor afbraak, en moet worden behandeld onder steriele omstandigheden. Nucleïnezuurbibliotheken verzameld uit microarrays kunnen zowel in DNA- of RNA-sequencing als bij het coderen van digitale informatie over DNA worden gebruikt.
De NED produceert een intens UV-licht dat niet direct bekeken mag worden. Daarom wordt geadviseerd om een beschermende bril te dragen terwijl het instrument in gebruik is.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
