Immunology and Infection
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干细胞衍生病毒Ag特异性T淋巴细胞抑制小鼠HBV复制
Chapters
Summary September 25th, 2019
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这里介绍了一个协议，通过利用干细胞衍生病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞的采用细胞转移（ACT），有效抑制小鼠乙型肝炎病毒（HBV）复制。这个程序可以适应潜在的基于ACT的HBV感染免疫治疗。
Transcript
该方法有助于回答采用基普斯克衍生病毒抗原特异性T细胞的细胞转移中的关键问题，有效抑制小鼠的HBV复制。该技术的主要优点是，iPSC衍生病毒抗原特异性T细胞具有单型T细胞受体和天真表型。为分化HBV特异性 iPSC CD8 阳性 T 细胞，在 OP9-DL1/DL4 单层上对 OP9-DL1/DL4 单层进行转导 iPSCs，辅以 20% 胎儿牛血清和 murine Flt3 配体，用于细胞培养孵化器中的共培养。
定期监测共培养，以评估细胞形态。第28天，取出上一直细胞和浮细胞，用0.25%的三辛分离粘附细胞。当细胞从培养容器底部提升时，停止用8毫升的 iPSC 培养的酶反应，通过离心收集细胞。
将颗粒重新在10毫升的新鲜介质中重新供应。将细胞稀释为一个 iPSC 衍生的 CD8 阳性 T 细胞，至四个 s183 肽脉冲血细胞比，在细胞培养箱中孵育 40 小时。在过去七小时内，在培养中加入四升稀释的布雷费尔丁 A 微升，以在细胞激活期间阻止传输过程。
根据标准协议，染色细胞进行细胞内细胞学分析，用于细胞内细胞因子。对于通过尾静脉输送水动力HBV质粒，稀释10微克的HBV质粒，其质量相当于PBS的8%。将质粒装入一个三毫升注射器中，每只鼠标装有 26 粒 1/2 英寸的针头。
在热灯下加热HHD小鼠5分钟，以扩张尾静脉，并小心地将鼠标拉入塑料约束器。在尾部的中间三分之一中定位一个扩张的横向尾静脉，并插入与静脉平行的针，在三到五秒的时间内通过尾静脉传递整个质粒体积。对于病毒抗原特异性iPSC衍生的CD8阳性T细胞的采用细胞转移，收集iPSC CD8阳性T细胞在培养的第22天如所证明，并播种细胞到一个新的10厘米细胞培养盘。
在细胞培养箱中30分钟后，通过70微米尼龙滤网过滤漂浮细胞，并计算活细胞。稀释细胞到每毫升PBS浓度的1.5倍10至7个细胞。如刚刚证明的，将200微升细胞注入单个4至6周大的HHD小鼠，注入尾静脉。
在细胞转移后的第14天，执行流体动力学HBV质粒交付，如证明。在感染后的适当实验终点，从每个受感染的动物中采集肝脏，将肝脏切成0.5到0.5到0.3厘米的组织样本。将样品放入10%中性缓冲液中4至24小时，随后在2.5摩尔甲酸中脱钙6至24小时。
接下来，用二甲苯冲洗样品三分钟，然后用100%乙醇、95%乙醇和去维化水冲洗两次两分钟。最后一次水洗后，在90摄氏度下将组织在1毫摩尔EDTA中去化，随后在室温下孵育30分钟。当组织冷却后，在PBS中冲洗样品4分钟，并使用二甲苯和乙醇去酸化和补水化样品。
对于免疫荧光贴标，在室温下75至100%加湿室中，用200微升HBV表面抗原特异性抗体染色两小时。在孵化结束时，每次洗涤用五分钟新鲜 PBS 清洗样品。在安装幻灯片之前，请根据标准协议对电池进行 DAPI 标记，然后使用盖玻片进行荧光显微镜成像。
对于免疫组织化学分析，根据标准方案用赤氧素和 eosin 染色部分，通过光显微镜评估炎症细胞渗入肝脏。对 iPSC 衍生 CD3 阳性 CD8 阳性人群的流细胞测量分析表明，HBV T 细胞受体转导显著增加病毒 s183 特异性 CD8 阳性 T 细胞的生成。使用S183肽脉冲的T-耗尽的飞溅细胞刺激后，CD4阴性CD8单阳性的ipPSC衍生T细胞会产生大量的干扰素伽马，如细胞内流量细胞测量分析和ELISA所检测到的。
在水动力注射感染HBV后，DNA复制在第六天达到峰值，并逐渐减少，通过实时PCR分析观察到。此外，与接受对照细胞的小鼠相比，接受HBV病毒抗原特异性T细胞的小鼠的病毒复制在所有时间点都显著减少。与使用对照细胞治疗的小鼠相比，接受HBV病毒抗原特异性前 iPSC 细胞毒性淋巴细胞的小鼠中，HBV表面蛋白也大幅减少，这清楚地表明病毒抗原特异性 iPSC CD8 阳性 T 细胞能够减少在 murine 模型中的 HBV 复制。
现在，您应该对如何从 iPSC 生成病毒抗原特异性 T 细胞进行很好的理解，以便采用免疫疗法。
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