11,541 Views
•
10:08 min
•
November 05, 2019
DOI:
Denne protokol har givet nogle af de bedste indsigter, vi har hidtil i, hvordan Candida albicans bebor pattedyr mave-tarmkanalen. For eksempel, indtil for nylig, vidste vi ikke rigtig, hvor Candida er lokaliseret i tarmen, eller hvilke af dens mange morfologiske former det antager inden for denne niche. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for at visualisere Candida inden for sit naturlige miljø uden at forstyrre de tre-dimensionelle interaktioner svampen har med værtsstrukturer eller med bakterier i mikrobiota.
Fordi tarmen er et komplekst miljø, er det meget svært at modellere i laboratoriet, og derfor har det været meget tilfredsstillende at finde en måde at sonde Candida biologi direkte i en værtsmodel. Visse komponenter i tarmen mikrobiota herunder Candida albicans er mistænkt for at spille roller i sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom. Denne teknik kan potentielt bruges til at diagnosticere tilstedeværelsen af specifikke mikroorganismer i biopsiprøver fra patienter.
Beherskelse af sonde teknik og evnen til at dissekere gastrointestinale segmenter uden at rive organerne er vigtigt for at opnå optimale resultater. For at starte, sonde hvert dyr med den beregnede volumen af en given inoculum. Fastgør en autoklaveret dyrefodernål til en millilitersprøjte, og fyld sprøjten med en sondevolumen, og sørg for at fjerne alle bobler.
Ansvar sprøjten på en steril overflade. For at sikre dyret, holde det i bunden af halen med den dominerende hånd og skub den ikke-dominerende hånd op dyrets ryg til den løse hud lige bag ørerne. Saml scruff sammen stramt med tommelfingeren og pegefingeren.
Saml dyret op ved scruffen, vend det om og sløjfe den lille finger på samme hånd rundt om halen for at immobilisere dyret mod håndfladen. Forsigtigt udvide dyrets hoved, så det er i en lige linje med kroppen. Derefter afhente sprøjten med den dominerende hånd og holde det vinkelret på dyret med den buede nål peger ned.
Brug bolden af nålen til forsigtigt krog en indvendig hjørne af munden og fremrykning nålen langs siden af munden til bagsiden af halsen, derefter flytte nålen til midten. Når kuglen af nålen er på bagsiden af dyrets hals, vippe nålen op, så det er parallelt med dyrets krop linje og lad det glide glat ned i halsen. Hvis nålen ikke glider jævnt ned i halsen, er nålen muligvis ikke korrekt placeret og skal trækkes tilbage for at flytte og prøve igen.
Glat frem nålen gør det muligt for dyret at sluge nålen, indtil kun et par millimeter forbliver synlige. Test, at kuglen af nålen er i maven ved forsigtigt at fremme stemplet, og hvis der ikke er nogen modstand, fortsætte med at levere inokulum. Træk langsomt nålen tilbage, når inokulumet er blevet administreret, og læg dyret i buret.
Fortsæt overvågningen af dyret i fem til 10 minutter for tegn på besværet vejrtrækning eller angst og kontrollere, at det genoptager normal aktivitet kort efter sonde. Hvis det samme inokulum vil blive brugt til det næste dyr, rengøres nålen med en alkoholservietter. Hvis der anvendes et andet inokulum, skal nålen udskiftes.
Brug stumpe kraftføringer til at klemme en del af bughulen og indsnit huden og den underliggende fascia nær bunden af bækkenet ved hjælp af en saks. Udvid snittet i en U-form langs hver side af bughulen og op til brystkassen, løft derefter huden af vejen. Brug stumpe kraftbeton til forsigtigt at udtrække cecum fra bughulen ved hjælp af en saks til at bryde forbindelserne mellem cecum og de små og store tarme.
Placer hele cecum i en histologi kassette, så det er ubehændet og lægger fladt. Placer den anden skumpude på toppen og luk kassetten. Derefter placere kassetten i en skruelåg krukke indeholdende methacarn.
Punktafgifter den del af tyktarmen, der indeholder en til to fækale pellets og har en længde mindre end kassetten. Placer vævet i kassetten, så det er fladt og uhåndterligt. Overlejr det med den anden skum pad, lukke kassetten og placere den i methacarn.
For hver del af tyndtarmen, der skal udtages prøver, punktafgifter en en til to centimeter segment, der indeholder nogle fordøjelsessystemet materiale. Placer vævet i kassetten, overlay med den anden skum pad, lukke kassetten og læg det i methacarn. Ved excising maven, afskære forbindelserne til spiserøret og tyndtarmen.
Placer vævet i kassetten og læg kassetten i methacarn. Lad kassetterne i methacarn-opløsningen ligge ved stuetemperatur i mindst tre timer, men mindre end to uger. Efter fikseringen fjernes skumpuderne, og hver intakt vævssektion returneres til kassetten.
Derefter vaskes væv to gange i 35 minutter i 100% methanol, to gange i 25 minutter i 100% ethanol, og to gange i 20 minutter i xylen. Pat kassetter tørre på en køkkenrulle og læg dem i en forsmeltet paraffin i to timer ved 70 grader Celsius i en hybridisering ovn. Fjern derefter kassetterne fra voks, lad den overskydende voks at dræne og gemme dem ved stuetemperatur, indtil de er indlejret i voks blokke.
Devoks den paraffin indlejret histologiske sektioner ved at indsætte dias i en forstemt krukke fyldt med xylen. Lad krukken ved 60 grader Celsius i 10 minutter, og kassér derefter xylenvasken. Hæld frisk stuetemperatur xylen i krukken og gentag inkubationen.
Fyld derefter glasset med 100% ethanol og inkuber den ved stuetemperatur i fem minutter. Efter inkubationen skal du fjerne objektglassene fra krukken og lufttørre dem. At plette C.albicans med en fisk sonde, starte med at tegne en cirkel omkring væv sektion ved hjælp af en Pat Pen.
Pipette 50 mikroliter af sonden indeholdende hybridiseringsopløsning på det faste væv og forsigtigt sprede det med pipettespidsen. Overlejr væsken med en hybridisering coverslip sørg for at forhindre bobler. Derefter forsegle dias i en vandtæt hybridisering kammer og inkubere sektionerne i tre timer ved 50 grader Celsius i en hybridisering ovn i mørke.
Efter inkubationen tilsættes vaskeopløsningen til en Coplin-krukke. Fjern forsigtigt dækslrækket fra sliden med sniver, og placer sliddet i vaskeopløsningen. Dæk krukken med aluminiumsfolie og inkubere det ved 50 grader Celsius i 20 minutter.
Vask derefter rutsjebanerne ved at hælde vaskeopløsningen af og fylde krukken op med PBS. Hæld straks af og genopfyldes med frisk PBS, der gentager processen i i alt to vaske. Wick væk PBS med en delikat opgave tørre og cirkel tarmvæv sektion med en Pat Pen.
Objektglassene i en uigennemsigtig plastbeholder og tilsæt 50 mikroliter mucinkernerfaringsopløsning til vævssektionen. Dæk beholderen med aluminiumsfolie og inkuber den ved fire grader Celsius i 45 minutter. Efter inkubationen, sætte dias i en Coplin krukke og vaske dem to gange med PBS.
Tryk væk overskydende PBS på en køkkenrulle og derefter væge væk de sidste dråber med et væv. Placer en dråbe monteringsmedium på hver sektion og overlejr det med et glas coverslip sørg for at forhindre bobler. Lad monteringsmediet spredes under hele dækslæbet.
Forankr dækslet på plads med neglelak i hjørnerne og billede dias ved hjælp af en fluorescerende mikroskop. Denne protokol kan bruges til fluorescerende mærke C.albicans in vitro og i vært væv. In vitro formeret hyphae, runde gærceller, tarmceller og uigennemsigtige celler blev fastsat, permeabiliseret, og skelnes med fluorescens og fase kontrast mikroskopi.
Runde gær og meget aflange hyphae blev afbildet i musens tyktarmer. Værtsvæv blev plettet med C.albicans specifikke sonde eller panfungal sonden. C.albicans var mærket rød, vært celle kerner blå, og slim lag grøn.
C.albicans blev påvist i forskellige segmenter af murine MAVE-tarmkanalen, herunder de regioner, der umiddelbart støder op til værtsslimhinden og mere centrale regioner i tarmlummen. For forskere, der ikke tidligere har udført sonde teknik, er det vigtigt at opnå specialiseret uddannelse, før du forsøger denne metode. Efter fisk farvning, immunfluorescerende teknikker kan bruges til at plette yderligere funktioner i værten slimhinden.
Dette kan give mulighed for karakterisering af vævsskader eller immunrespons af værten. Denne teknik har givet os mulighed for at karakterisere forholdet mellem svampecellemorfologi af Candida albicans mutanter og overlevelse inden for værten fremme vores forståelse af Candida albicans biologi, der kan udnyttes, når de udvikler behandlinger.
Formålet med denne protokol er at visualisere Candida albicans celle form og lokalisering i pattedyrs mave-tarmkanalen.
Read Article
Cite this Article
Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (153), e60283, doi:10.3791/60283 (2019).
Copy