Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Questo protocollo ha prodotto alcune delle migliori intuizioni che abbiamo finora su come Candida albicans abita il tratto gastrointestinale dei mammiferi. Ad esempio, fino a poco tempo fa, non sapevamo davvero dove Candida è localizzata all’interno dell’intestino o quale delle sue numerose forme morfologiche assume all’interno di questa nicchia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di visualizzare Candida all’interno del suo ambiente naturale senza interrompere le interazioni tridimensionali che il fungo ha con le strutture ospiti o con i batteri nel microbiota.

Poiché l’intestino è un ambiente complesso, è molto difficile da modellare in laboratorio e quindi è stato molto soddisfacente trovare un modo per sondare la biologia di Candida direttamente in un modello ospite. Alcuni componenti del microbiota intestinale tra cui gli albicani Candida sono sospettati di svolgere ruoli in malattie come la malattia infiammatoria intestinale. Questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per diagnosticare la presenza di microrganismi specifici in campioni di biopsia ottenuti da pazienti.

La padronanza della tecnica del gavage e la capacità di sezionare i segmenti gastrointestinali senza strappare gli organi è importante per ottenere risultati ottimali. Per iniziare, gavage ogni animale con il volume calcolato di un dato inoculo. Attaccare un ago da alimentazione animale autoclavato a una siringa da un millilitro e riempire la siringa con un volume di gavage assicurandosi di rimuovere tutte le bolle.

Posizionare la siringa su una superficie sterile. Per fissare l’animale, tienilo alla base della coda con la mano dominante e fai scorrere la mano non dominante sulla schiena dell’animale sulla pelle sciolta appena dietro le orecchie. Raccogliere saldamente la trasandata con il pollice e l’indice.

Prendi l’animale per la trasanda, capovolgelo e gira il piccolo dito della stessa mano intorno alla coda per immobilizzare l’animale contro il palmo della mano. Estendere delicatamente la testa dell’animale in modo che sia in linea retta con il corpo. Quindi raccogliere la siringa con la mano dominante e tenerla perpendicolare all’animale con l’ago curvo rivolto verso il basso.

Utilizzare la palla dell’ago per agganciare delicatamente un angolo interno della bocca e far avanzare l’ago lungo il lato della bocca verso la parte posteriore della gola, quindi spostare l’ago al centro. Una volta che la palla dell’ago è nella parte posteriore della gola dell’animale, inclinare l’ago verso l’alto in modo che sia parallelo alla linea del corpo dell’animale e consentirgli di scivolare senza intoppi in gola. Se l’ago non scivola senza intoppi in gola, l’ago potrebbe non essere posizionato correttamente e deve essere ritirato per riposizionarsi e riprovare.

Avanzare senza problemi l’ago permettendo all’animale di ingoiare l’ago fino a quando rimangono visibili solo pochi millimetri. Prova che la palla dell’ago è nello stomaco facendo avanzare delicatamente lo stantuffo e se non c’è resistenza, continua a fornire l’inoculo. Ritirare lentamente l’ago una volta che l’inoculo è stato somministrato e posizionare l’animale nella sua gabbia.

Continuare a monitorare l’animale per cinque o 10 minuti per i segni di respirazione o angoscia travaglio e verificare che riprenda la normale attività subito dopo il gavage. Se lo stesso inoculo verrà utilizzato per il prossimo animale, pulire l’ago con una salvietta alcolica. Se verrà utilizzato un inoculo diverso, sostituire l’ago.

Utilizzare le forcep contundenti per pizzicare una sezione della pelle addominale e incidere la pelle e la fascia sottostante vicino alla base del bacino usando le forbici. Estendere l’incisione a forma di U lungo ciascun lato della cavità peritoneale e fino alla gabbia toracica, quindi sollevare la pelle fuori strada. Utilizzare forcep smussate per estrarre delicatamente il cieco dalla cavità peritoneale usando le forbici per remare le connessioni tra il cieco e l’intestino tenue e crasso.

Posizionare l’intero cieco in una cassetta istologia in modo che non sia istigato e giace piatto. Posizionare il secondo cuscinetto di schiuma sopra e chiudere la cassetta. Quindi posizionare la cassetta in un barattolo di tappo a vite contenente metacarno.

Asportare la sezione dell’intestino crasso che contiene da uno a due pellet fecali e ha una lunghezza inferiore a quella della cassetta. Posizionare il tessuto nella cassetta mantenendolo piatto e non ististed. Sovrapporre con il secondo cuscinetto di schiuma, chiudere la cassetta e posizionarla nel metacarno.

Per ogni sezione dell’intestino tenue da campionare, asportare un segmento da uno a due centimetri che contiene del materiale digestivo. Posizionare il tessuto nella cassetta, sovrapporre con il secondo cuscinetto di schiuma, chiudere la cassetta e metterla nel metacarno. Quando si eccita lo stomaco, cidere le connessioni all’esofago e all’intestino tenue.

Mettere il tessuto nella cassetta e posizionare la cassetta nel metacarno. Lasciare le cassette nella soluzione di metacarno a temperatura ambiente per almeno tre ore ma meno di due settimane. Dopo la fissazione, rimuovere i cuscinetti di schiuma e riportare ogni sezione di tessuto intatta nella sua cassetta.

Quindi lavare i tessuti due volte per 35 minuti in metanolo al 100%, due volte per 25 minuti in etanolo al 100% e due volte per 20 minuti in xilene. Asciugare le cassette su un tovagliolo di carta e posizionarle in una cera di paraffina pre-fusa per due ore a 70 gradi Celsius in un forno di ibridazione. Quindi rimuovere le cassette dalla cera, lasciare che la cera in eccesso scarichi e conservarle a temperatura ambiente fino a quando non sono incorporate in blocchi di cera.

Scissare la paraffina incorporata sezioni istologiche inserendo le diapositive in un barattolo pre-riscaldato pieno di xilene. Lasciare il barattolo a 60 gradi Celsius per 10 minuti, quindi scartare il lavaggio in xilene. Versare lo xilene fresco a temperatura ambiente nel barattolo e ripetere l’incubazione.

Quindi riempire il barattolo con etanolo al 100% e incubarlo a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l’incubazione, rimuovere gli scivoli dal barattolo e asciugarli all’aria. Per macchiare i C.albicans con una sonda di pesce, inizia disegnando un cerchio intorno alla sezione tissutale usando una Pat Pen.

Pipetta 50 microlitri di sonda contenenti soluzione di ibridazione sul tessuto fisso e stenderlo delicatamente con la punta della pipetta. Sovrapporre il liquido con un coverslip di ibridazione assicurandosi di prevenire bolle. Quindi sigillare gli scivoli in una camera di ibridazione a tenuta d’acqua e incubare le sezioni per tre ore a 50 gradi Celsius in un forno di ibridazione al buio.

Dopo l’incubazione, aggiungere la soluzione di lavaggio a un barattolo di Coplin. Rimuovere con cura il coverslip dallo scivolo con le forcep e posizionare lo scivolo nella soluzione di lavaggio. Coprire il barattolo con un foglio di alluminio e incubarlo a 50 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, lavare gli scivoli versando la soluzione di lavaggio e riempiendo il barattolo con PBS. Versare immediatamente e riempire con PBS fresco ripetendo il processo per un totale di due lavaggi. Assorbi il PBS con una delicata pulizia del compito e cerchia la sezione del tessuto intestinale con una Pat Pen.

Posizionare i vetrini in un contenitore di plastica opaco e aggiungere 50 microlitri di soluzione di colorazione dei nuclei di mucina alla sezione tissutale. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio e incubarlo a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l’incubazione, mettere le diapositive in un barattolo di Coplin e lavarle due volte con PBS.

Toccare il PBS in eccesso su un tovagliolo di carta e quindi assorbire le gocce finali con un tessuto. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio su ogni sezione e sovrapporla con una coverlip di vetro assicurandosi di evitare bolle. Lasciare che il mezzo di montaggio si diffonda sotto l’intero coverslip.

Ancorare il coverslip in posizione con smalto agli angoli e immagini le diapositive utilizzando un microscopio fluorescente. Questo protocollo può essere utilizzato per etichettare fluorescentmente i C.albicans in vitro e nei tessuti ospiti. L’ifae propagata in vitro, le cellule rotonde del lievito, le cellule intestinali e le cellule opache erano fisse, permeabilizzate e distinte con la fluorescenza e la microscopia a contrasto di fase.

Lieviti rotondi e ife altamente allungate sono stati imageati nell’intestino crasso del topo. I tessuti ospiti sono stati macchiati con la sonda specifica C.albicans o la sonda panfungina. I C.albicans erano etichettati come rossi, i nuclei delle cellule ospiti blu e lo strato di muco verde.

I C.albicans sono stati rilevati in diversi segmenti del tratto ig murino, comprese le regioni immediatamente adiacenti alla mucosa ospite e le regioni più centrali del lume intestinale. Per gli scienziati che non hanno precedentemente eseguito la tecnica del gavage, è importante ottenere una formazione specializzata prima di tentare questo metodo. Dopo la colorazione del pesce, le tecniche immunofluorescenti possono essere utilizzate per macchiare caratteristiche aggiuntive della mucosa ospite.

Ciò può consentire la caratterizzazione del danno tissutale o delle risposte immunitarie dell’ospite. Questa tecnica ci ha permesso di caratterizzare la relazione tra la morfologia cellulare fungina dei mutanti candida albicans e la sopravvivenza all’interno dell’ospite, promuovere la nostra comprensione della biologia candida albicans che può essere sfruttata quando si sviluppano terapie.