Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.