Neuroscience
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जन्म के पूर्व Isl मिलियन से ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की अलगाव और संस्कृति: जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहे
Chapters
Summary November 12th, 2019
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यह काम प्राथमिक ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की सजातीय कोशिका संस्कृतियों को उपज देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इन संस्कृतियों का उपयोग नेत्र और रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Transcript
भ्रूण चूहों से एक साथ और कुशलता से शुद्ध और संस्कृति प्राथमिक नेत्र और रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के लिए यह पहला प्रोटोकॉल है। यह मोटर न्यूरॉन रोग अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन में सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मौजूदा प्रणालियों के लिए विट्रो ऑक्यूलोमोटर संस्कृति घटक में एक उपन्यास जोड़ता है और तुलना के लिए शुद्ध प्रजातियों और उम्र मिलान रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों प्रदान करता है।
एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस में, स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स पतित होते हैं जबकि ऑकुलोमोटर न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत बख्शे जाते हैं। इन संस्कृतियों की तुलना रोग तंत्र और चिकित्सा में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । इस विधि मोटर न्यूरॉन विकास, रोग, और चयनात्मक भेद्यता अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन की सुविधा होगी।
हमारी संस्कृति प्रणाली मोटर न्यूरॉन आकृति विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लक्षण वर्णन में सक्षम बनाता है। इस तकनीक के लिए नए लोगों के लिए, हम बहुत सारे अभ्यास की सलाहते हैं। विच्छेदन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्राथमिक संस्कृति के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए कई विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती है।
निषेचन के लगभग 11.5 दिनों के बाद एक गर्भवती माउस से Islet1 EGF सकारात्मक भ्रूण की कटाई से शुरू करें। पेट को इथेनॉल से अच्छी तरह से स्प्रे करें और बाँझ माइक्रोडिसेक्शन कैंची और अंगूठे के ड्रेसिंग संदंश के साथ गर्भाशय को हटा दें। बाँझ पीबीएस में गर्भाशय को संक्षेप में धोएं।
फिर इसे पूर्व-ठंडा बाँझ पीबीएस से भरे विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोप की तेज रोशनी के नीचे, माइक्रोडिसेक्शन कैंची, अंगूठे ड्रेसिंग टैंप्स और ड्यूमोंट 5 चिमटी का उपयोग करके गर्भाशय से भ्रूण को ध्यान से हटा दें। फिर 1X V27 के साथ पूरक पूर्व ठंडा हाइबरनेट ई कम फ्लोरेसेंस मध्यम से भरे 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक अलग कुएं में प्रत्येक भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ मोरिया मिनी छिद्रित चम्मच का उपयोग करें।
जबकि बर्फ पर थाली रखते हुए, एक भ्रूण को बाँझ विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ के ठंडे बाँझ हैंक के संतुलित नमक समाधान या एचबीबीएस के साथ पूरी तरह से कवर करें। मिडब्रेन को नुकसान पहुंचाए बिना भ्रूण और पूंछ के चेहरे को हटाने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। फिर भ्रूण को सूक्ष्मदर्शी के सामने की ओर इशारा करते हुए अंगों और पूंछ के साथ प्रवण रखें।
एक छोटे से खोलने को उत्पन्न करने के लिए चौथे वेंट्रिकल की छत खोलने के लिए चिमटी का उपयोग करें। चौथे वेंट्रिकल और उसकी छत के बीच बनाई गई जगह में चिमटी हुक करने के लिए इस उद्घाटन का उपयोग करें। भ्रूण रोस्ट्रल की पृष्ठीय सतह के साथ कॉर्टेक्स और पार्श्व को फर्श प्लेट और मोटर कॉलम में विच्छेदन करें।
फिर GFP सकारात्मक CN3 और CN4 नाभिक प्रकट करने के लिए एक खुली किताब तरीके से विच्छेदित ऊतक खोलें। ध्यान से वेंट्रल मिडब्रेन को भ्रूण से अलग करें और चिमटी और माइक्रोडिसेक्शन चाकू के साथ मेनिंगियल ऊतक को हटा दें। द्विपक्षीय GFP सकारात्मक CN3 और CN4 नाभिक फर्श की थाली और अंय GFP सकारात्मक आसपास के ऊतकों से दूर विच्छेदन को छूने या न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ध्यान दे रही है ।
यदि अलग सीएन 3 और सीएन 4 नाभिक एकत्र करते हैं, तो इन दोनों नाभिक के मिडब्रेन के साथ काटें और न्यूनतम एचबीबीएस के साथ विच्छेदित वेंट्रल मिडब्रेन ऊतक एकत्र करने के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करें। इसे विच्छेदन माध्यम से भरे 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और विच्छेदन तक बर्फ पर ट्यूब स्टोर करें। एक ही ट्यूब में अतिरिक्त भ्रूण से वेंट्रल मिडब्रेन खींच जारी रखें जब तक कुल संख्या प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करती है।
वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को विच्छेदन करने के लिए, भ्रूण को माइक्रोस्कोप के सामने सिर के साथ प्रवण रखें। इसे चिमटी की एक जोड़ी के साथ पकड़ें और चौथे वेंट्रिकल के खुले कौडल हिस्से में दूसरी जोड़ी की नोक डालें। भ्रूण की पूरी रोस्ट्रोकाउडल सीमा पर हिंडब्रेन और रीढ़ की हड्डी के बाकी को डोरसली खोलें।
चौथे वेंट्रिकल से शुरू होने वाले पृष्ठीय ऊतक को काटें और कैंची के रूप में संदंश का उपयोग करके कौडल रीढ़ की हड्डी की केंद्रीय नहर की ओर काम करें। फिर चिमटी के एक सेट के साथ भ्रूण पकड़ो और दूसरी जोड़ी के साथ प्रत्येक पक्ष पर पृष्ठीय ऊतक के फ्लैप से चुटकी । माइक्रोडिसेक्शन चाकू का उपयोग करके वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को निकालें जीएफपी पॉजिटिव एसएमएन के नीचे सीधे छेदने के लिए दोनों तरफ आरी जैसी हरकतों के साथ वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को उठा रहे हैं।
रीढ़ की हड्डी को निचले अंग की ऊपरी सीमा पर धीरे से काटें और सर्वाइकल काठ के हिस्से को हटा दें। C1 के ऊपर सीधे कट करें जहां पहले जीएफपी सकारात्मक पूर्वकाल हॉर्न परियोजनाएं हैं। वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें और चिमटी की एक जोड़ी के साथ जीएफपी सकारात्मक एसएमएन कॉलम के बीच जीएफपी नकारात्मक ऊतक को दबाकर इसे पकड़ें।
माइक्रोडिसेक्शन चाकू के साथ जीएफपी पॉजिटिव एसएमएन कॉलम के दोनों किनारों को ट्रिम करके शेष संलग्न मेसेन्किम, डीआरजी और पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी को हटा दें। न्यूनतम एचबीएसएस के साथ विच्छेदित वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें और इसे विच्छेदन माध्यम से भरे हुए 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। इसे बर्फ पर तब तक स्टोर करें जब तक कि वियोजन न हो जाए और एक ही ट्यूब में अतिरिक्त भ्रूण से वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड खींचना जारी रखें।
विच्छेदित ऊतक नमूनों के साथ प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पापीन समाधान की उचित मात्रा जोड़ें। ट्यूबों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो उंगली फ्लिकिंग द्वारा हर 10 मिनट में ट्यूबों को उत्तेजित करते हैं। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से एक P200 पिपेट के साथ आठ बार प्रत्येक निलंबन triturate और पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर अपकेंद्रित्र ।
सेल छर्रों को एल्बुमिन ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान की उचित मात्रा के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पुनर्सुविव्य करें। अपकेंद्रित्रता दोहराएं। फिर ध्यान से एक P1000 पिपेट के साथ सुपरनैट हटा दें।
विच्छेदन माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। 70 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें। इसके बाद, CN3/CN4 और SMN से विच्छेदित GFP सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए FACS छंटाई का उपयोग करें ।
मोटर न्यूरॉन संस्कृति माध्यम के साथ अलग सेल निलंबन पतला उचित घनत्व के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम और एक पीडीएल laminin-लेपित ९६-अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में निलंबन के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । संस्कृति एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में न्यूरॉन्स मोटर न्यूरॉन संस्कृति माध्यम हर पांच दिनों को ताज़ा करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। जब सफलतापूर्वक अलग न्यूरॉन्स संस्कृति में बड़े हो गए थे, लगभग शुद्ध प्राथमिक CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों प्राप्त की और विट्रो में 14 दिनों के लिए बनाए रखा गया ।
इन विट्रो में दो दिनों में संस्कृतियों की शुद्धता CN3/CN4 के लिए ९३.५%और SMN के लिए ८६.७%थे जब मोटर न्यूरॉन मार्कर Islet1 और न्यूरोनल मार्कर TUJ1 के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया । शुद्धता भ्रूण की उम्र पर और FACS के दौरान GFP फाटकों के लिए उपयुक्त थ्रेसहोल्ड स्थापित करने पर काफी भरोसा किया । E10.5 भ्रूण से अलग न्यूरॉन्स की शुद्धता E11.5 भ्रूण के उन लोगों के लिए तुलनीय थे।
हालांकि, जब E13.5 भ्रूण का उपयोग किया गया तो शुद्धता में काफी कमी आई। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्राथमिक CN3/CN4s और SMNs ने एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनावों के लिए अंतर प्रतिक्रियाएं दिखाईं, कोशिकाओं को विट्रो में दो दिनों में साइक्लोपियाज़ोनिक एसिड या सीपीए की अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया और तीन दिन बाद इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए अस्तित्व के अनुपात का मूल्यांकन करने के लिए तय किया गया । प्रत्येक नमूने में व्यवहार्य न्यूरॉन्स की संख्या गिना गया था और अस्तित्व अनुपात की गणना की गई थी।
CN3/CN4 मोनोकल्चर एसएमएन मोनोकल्चर की तुलना में सीपीए उपचार के लिए काफी अधिक प्रतिरोधी थे। इस प्रक्रिया के बाद, मोटर न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए कई अतिरिक्त तरीके किए जा सकते हैं। कुछ उदाहरणों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, सेल बायोलॉजी, ट्रांसक्रिप्शन या क्रोमेटिन एक्सेसिबिलिटी के अध्ययन शामिल हैं।
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