Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager
Chapters
Summary November 1st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Præsenteret her er en protokol til påvisning af makrofag ekstrellulær fælde (MET) produktion i levende cellekultur ved hjælp af mikroskopi og fluorescens farvning. Denne protokol kan udvides yderligere til at undersøge specifikke MARKEDSført protein markører ved immunofluorescens farvning.
Transcript
Frigivelsen af ekstracellulære fælder af neutrofiler og andre immunceller er vigtig i medfæstet immunitet, men også stærkt forbundet med inflammatoriske patologier. Meget lidt er kendt om denne proces i makrofager, selv om disse celler spiller en afgørende rolle i inflammatorisk respons. Denne protokol giver en primær menneskelig in vitro model af makrofager ekstracellulære fælde eller mast frigivelse.
Det giver en model for os at studere en potentiel fysiologisk vækst af denne struktur in vivo. Den største fordel ved denne teknik er, at cellerne fra denne protokol er primære celler isoleret fra menneskelige buffy pels præparater. Der kræves ingen primingtrin for at differentiere monocytet i makrofager, hvilket står i kontrast til andre monocytcellelinje som THP-1 cellelinje.
Denne protokol er let tilpasset til andre immunceller, herunder isolerede neutrofil og mikroglia. Ekstracellulær fælde produceret af makrofager er meget skrøbelige, så der skal tages hensyn mellem skridt til at bevare integriteten af de farvede fælder. Under sterile forhold forberedes M1 priming medium ved at tilføje til den komplette RPMI-1640 kulturmedier, interferon gamma til koncentrationen af 20 nanogram per milliliter og lipopolysaccharid til koncentrationen af et mikrogram pr. milliliter.
Forbered M2 priming media ved at tilføje interleukin 4 til den komplette RPMI-1640 kultur medier til koncentrationen af 20 nanogram per milliliter. Under sterile forhold, aspirere medier fra den seedede og dyrkede væv kultur plade brønde, der indeholder HMDM. Tilføj forsigtigt i hver brønd, en milliliter steril PBS forvarmt til 37 grader Celsius.
Fjern PBS-bufferen, og vask to ekstra gange. Tilføj en milliliter af enten M1 eller M2 priming medier til hver brønd, der indeholder HMDM. Inkuber cellerne i 48 timer ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celleinkubator.
Under sterile forhold skal du forberede kulturmediet, der indeholder forskellige stimulatorer af MET-frigivelse til hele RPMI-1640-mediet. Til forsøg med hypochlorsyrestimulation forberedes 200 mikromolar hypochlored syre i et Falcon-rør med HBSS, der er blevet forvarmtet til 37 grader Celsius. Efter polariseringsbehandlingen skal cellemediet aspirere fra hver brønd og omhyggeligt vaske cellerne tre gange med en milliliter aliquots af enten steril PBS for PMA, TNF alpha og interleukin 8 stimulation eller HBSS for hypochlorøsyrestimulation.
Når PBS er fjernet i det sidste vasketrin, skal der tilføjes en milliliter komplette medier, der indeholder PMA, TNF alpha eller interleukin 8. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en celle inkubator i seks timer for TNF alpha stimulation og 24 timer for PMA eller interleukin 8 stimulation. Til forsøg med hypochlorsyre tilsættes en milliliter frisklavet hypochlorsyre efter fjernelse af HBSS i det sidste vasketrin.
Derefter inkuberes cellerne i 15 minutter ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celle inkubator. Derefter aspirere cellernes supernatant omhyggeligt og cellerne tre gange med en milliliter aliquots af HBSS. Når HBSS er fjernet fra det sidste vasketrin, skal du tilføje en milliliter komplette RPMI-1640-kulturmedier.
Derefter inkuberes cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celle inkubator. SYTOX grøn farvestof i HBSS klargør sig ved en koncentration på 40 mikromolar. Tilføj direkte 25 mikroliter af farvestoffet til hver brønd, der indeholder HMDM.
Inkuber celler ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke. Derefter placere HMDM i væv kultur brønde på mikroskop fase af en omvendt fluorescerende mikroskop til billeddannelse. Tænd for en bredspektret lyskilde, lyskilde med skarpt felt og omvendt mikroskop, der er installeret med et farve digitalt kamera med høj opløsning.
Filterhjulet drejes til den to største position for grøn fluorescens med excitation ved 504 nanometer og dimension ved 523 nanometer. Brug 5X objektivet, fokusere billedet med det grove fokus derefter fine fokus knapper på mikroskopet, indtil billedet ser skarpe, klare og fokuserede. Skift mikroskopet til kameratilstand.
Start den tilknyttede software. Klik på knappen Afspil for at få vist billedet og justere den fine fokusknap på mikroskopet, indtil billedet ser skarpt, klart og fokuseret ud i softwareeksempelvinduet. Klik på knappen Hent.
Klik på Filer i softwaren. Gem som den nødvendige billedfiltype. På mikroskopet skal du dreje filterhjulet til nummer fem-positionen for billeddannelse med lyse felt, og gentag hentningsprocedurerne for at få det tilsvarende lysfeltbillede.
Bright-field billeder, der viser de morfologiske ændringer af HMDM som reaktion på stimuli er vist her. M1-polariserede makrofager fra eksperimenter med HMDM udsat for interferon gamma og lipopolysaccharid viste en aflang og spindel-lignende celleform. Til sammenligning var morfologien af de M2-polariserede makrofager efter eksponering af HMDM for interleukin 4 i 48 timer typisk runde og flade.
Muligheden for differentierede HMDM fænotyper til at frigive METs blev visualiseret ved live-celle fluorescens imaging med SYTOX grøn. Kontrollen fra hver HMDM fænotype inkuberet i 24 timer i mangel af nogen pro-inflammatoriske stimuli viste meget begrænset grøn farvning. Positiv farvning for METs, vist som grønne striber, blev opnået ved eksponering af M1-HMDMs for hypochlorsyre, PMA, interleukin 8 eller TNF alpha.
Tilstedeværelsen af nogle grønne farvning synlige i cellerne afspejler tab af membran integritet, som kan skyldes celledød, der er uafhængig af ekstracellulære fælde frigivelse. De forsøg, der blev udført med M2-HMDMs, der blev eksponeret for interleukin 4, viste ingen frigivelse af DNA fra cellerne, som det fremgår af fraværet af strengene eller striberne af ekstracellulært DNA. Men, der var nogle cellulære optagelse af grønne fluorescerende farvestof med hypochlorsyre og TNF alpha.
Det er vigtigt at undgå det direkte klare lys, som kan overeksponere farvning før billeddannelse. Ekstracellulært DNA kan kvantificeres ved qPCR-analyse af nuklear og mitokondrielt DNA, der er til stede i cellesupernatant. Yderligere karakterisering af mast struktur og dens roller i kronisk inflammation ved hjælp af HMDM kan være mere klinisk relevant i forhold til andre udødeliggjorte cellelinje makrofager butikker.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
