Biologiske prøver Forberedelse til speciering ved kryogen temperatur ved hjælp af røntgenabsorptionsspektroskopi med høj opløsning

Denne protokol er blevet standardiseret for cellulære prøver, hvilket gør det muligt at sammenligne eksperimenter, der kører på forskellige synkrotronplaceringer. Den største fordel ved denne teknik er en enkel og ligetil arbejdsgang, der muliggør en hurtig og pålidelig bevarelse af prøvens kemiske integration. Personer, der er nye til denne teknik, kan kæmpe med de frosne itererede celler pelletering og den hurtige belastning af den cellulære pellet i cryosample rækkefølgen.

En præcis og hurtig afkobling af en prøve i kryogen temperatur er kritisk. Som sådan er en visuel demonstration en vigtig for at forstå, hvordan man udfører teknikken. For at forberede cellepiller i human prostata- og æggestokkræftcellelinje til selenspeciering skal man indsæde det passende antal celler fra hver cellelinje i tre T-75-kolber pr. tilstand i det relevante cellekulturmedium i en laminær strømningshætte og anbringe kolberne i 37 grader Celsius og 5 % kuldioxidcellekulturinkubator, indtil cellerne er 80 % sammenflydende.

For at udsætte kræftcellerne for selenbehandling skal du først sonikere frisklavede nanopartikelopløsninger i et ultralydsvandbad i 30 minutter ved stuetemperatur, før selennanopartikelopløsningen serielt fortyndes i komplet cellekulturmedium til de relevante arbejdskoncentrationer. I den laminære flowhætte vaskes cellerne forsigtigt to gange med fem ml 37 grader Celsius PBS pr. vask, og der anvendes en steril pipette på 25 ml til forsigtigt at tilsætte 15 ml selenbehandling af interesse til bunden af kolben. Lågene lukkes uden at forsegle kolben helt, og kolberne anbringes vandret i cellekulturinkubatoren i 24 timer.

For at forberede cellepillerne efter vask og genopfyldning af kulturmediet skal du bruge en celleskraber pr. Kolbe til forsigtigt at løsne cellerne. Brug medium til at skylle eventuelle celler, der sidder fast i kolben, ind i supernatanten og opsaml de dissocierede celler ved centrifugering. Vask pellets to gange i fem milliliter PBS pr. rør pr. vask for at fjerne alle resterende spor af behandlingen og resuspend cellerne i en milliliter PBS.

Overfør cellerne til et 1,5 ml polypropylenrør og opsaml cellerne med en anden centrifugering. Brug derefter en 200 mikroliter pipette til forsigtigt at fjerne hele supernatanten og dykke den nederste del af hvert 1,5 ml rør i flydende nitrogen til niveauet af cellepillen. Umiddelbart efter frysning overføres rørene til en flydende nitrogendewar til langtidsopbevaring.

Ved røntgenabsorptionsspektroskopi i høj opløsning skal alle krystallerne fra krystalanalysatorspektrometeret optimeres under Bragg-forhold med hensyn til fluorescenslinjeenergien af interesse og anvende en reference, for hvilken absorptionskantens energiposition er kendt for at kalibrere den indfaldende monokromatiske stråleenergi. Overfør prøveholderen til en flydende heliumkrøostat til biologiske prøver, og sæt kryostaten til 10 grader Kelvin, luk derefter forsøgskabinen efter synkrotronsikkerhedsreglerne, og start analysen. Her viser repræsentative højopløselige røntgenabsorptionsspektroskopispektre af selen i indledende tilstand og i celler inkuberet til næringsmedium, at selen i de oprindelige selennanopartikler var til stede som både selen nul og cellulitelignende former.

Efter interaktioner med PC3-cellerne var selen dog hovedsageligt til stede i cellerne som selen nul, hvilket viste en ændring af selenarter i cellerne. For jern udviser referencespektre med høj opløsning røntgenabsorptionsspektroskopi forskellige kantpositioner afhængigt af jernoxidationstilstanden, med reducerede jernarter skiftet til lave energiværdier. To på hinanden følgende spektre indsamlet på samme position af en kiselpille var ens, hvilket indikerer, at stråleskaden var begrænset mellem to erhvervelser ved anvendelse af en heliumkromoostat ved 10 Kelvin.

Desuden var spektre fra forskellige positioner af kiselpillen identiske, hvilket viste, at prøvepillen var homogen, og at spektrene kunne gennemsnitliggøres for at opnå et bedre signal-støj-forholdsspektrum. De mest kritiske trin er fremstillingen af nanopartikeldituionen, pelletering ved kryogen temperatur og fremstilling af standardreferenceprøverne. Denne procedure kan anvendes på andre bulkanalytiske teknikker, såsom ICP-MS eller HPLC-ICP-MS eller andre ikke-synkrotronspektroskopiske teknikker, der kan udføres ved kryogen temperatur.

Andre videnskabelige spørgsmål kan udforskes ved hjælp af denne procedure, især inden for biogeologi, biokemi og miljøvidenskab eller toksikologiforskning. Selenforbindelser og selennanopartikler kan være lige så besværlige for dit helbred og bør manipuleres i en dedikeret kemisk hætte ved hjælp af handsker, briller og en ansigtsmaske.