Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

Questo protocollo è stato standardizzato per i campioni cellulari, consentendo il confronto di esperimenti in esecuzione in diverse posizioni di sincrotrone. Il vantaggio principale di questa tecnica è un flusso di lavoro semplice e diretto che consente una conservazione rapida e affidabile dell’integrazione chimica del campione. Gli individui nuovi a questa tecnica possono avere difficoltà con la pellettizzazione delle cellule iterate congelate e il caricamento rapido del pellet cellulare nell’ordine del criocampione.

Uno scollegamento preciso e rapido di un campione in temperatura criogenica è fondamentale. Come tale, una dimostrazione visiva è essenziale per capire come eseguire la tecnica. Per preparare i pellet cellulari della linea cellulare della prostata umana e del cancro ovarico per la speciazione del selenio, seminare il numero appropriato di cellule da ciascuna linea cellulare in tre palloni T-75 per condizione nel terreno di coltura cellulare appropriato in una cappa a flusso laminare e posizionare i palloni in 37 gradi Celsius e 5% incubatore di coltura cellulare di anidride carbonica fino a quando le cellule sono confluenti all’80%.

Per esporre le cellule tumorali al trattamento con selenio, prima sonicare soluzioni stock di nanoparticelle appena preparate in un bagno d’acqua ad ultrasuoni per 30 minuti a temperatura ambiente prima di diluire in serie la soluzione di nanoparticelle di selenio in un terreno di coltura cellulare completo alle concentrazioni di lavoro appropriate. Nella cappa a flusso laminare, lavare delicatamente le celle due volte con cinque millilitri di PBS a 37 gradi Celsius per lavaggio e utilizzare una pipetta sterile da 25 millilitri per aggiungere con cura 15 millilitri del trattamento al selenio di interesse sul fondo del pallone. Chiudere i coperchi senza sigillare completamente il matraccio e posizionare i palloni orizzontalmente nell’incubatore di colture cellulari per 24 ore.

Per preparare i pellet cellulari dopo il lavaggio e il reintegro del terreno di coltura, utilizzare un raschietto cellulare per pallone per staccare delicatamente le cellule. Utilizzare il mezzo per lavare tutte le cellule attaccate al pallone nel surnatante e raccogliere le cellule dissociate mediante centrifugazione. Lavare il pellet due volte in cinque millilitri di PBS per tubo per lavaggio per rimuovere tutte le tracce rimanenti del trattamento e risospescere le cellule in un millilitro di PBS.

Trasferire le cellule in un tubo di polipropilene da 1,5 millilitri e raccogliere le celle con un’altra centrifugazione. Quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rimuovere delicatamente tutto il surnatante e immergere la parte inferiore di ciascun tubo da 1,5 millilitri in azoto liquido a livello del pellet di cella. Immediatamente dopo il congelamento, trasferire i tubi in un dewar di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Per la spettroscopia di assorbimento dei raggi X ad alta risoluzione, ottimizzare tutti i cristalli dello spettrometro dell’analizzatore di cristalli in condizioni di Bragg rispetto all’energia della linea di fluorescenza di interesse e utilizzare un riferimento per il quale la posizione energetica del bordo di assorbimento è nota per calibrare l’energia del fascio monocromatico incidente. Trasferire il portacampioni su un criostato ad elio liquido per campioni biologici e impostare il criostato a 10 gradi Kelvin, quindi chiudere la gabbia sperimentale seguendo le regole di sicurezza del sincrotrone e iniziare l’analisi. Qui, gli spettri rappresentativi di spettroscopia di assorbimento dei raggi X ad alta risoluzione del selenio nello stato iniziale e nelle cellule incubate in mezzo nutritivo dimostrano che il selenio nelle nanoparticelle di selenio iniziali era presente sia come forme di selenio zero che di cellulite.

Dopo le interazioni con le cellule PC3, tuttavia, il selenio era presente principalmente nelle cellule come selenio zero, dimostrando un cambiamento delle specie di selenio all’interno delle cellule. Per il ferro, gli spettri di riferimento della spettroscopia di assorbimento dei raggi X ad alta risoluzione presentano posizioni di bordo distinte a seconda dello stato di ossidazione del ferro, con specie ridotte di ferro spostate a valori di bassa energia. Due spettri successivi raccolti sulla stessa posizione di un pellet di diatomee erano simili, indicando che il danno del fascio era limitato tra due acquisizioni quando si utilizzava un criostato di elio a 10 Kelvin.

Inoltre, gli spettri provenienti da diverse posizioni del pellet di diatomee erano identici, dimostrando che il pellet campione era omogeneo e che gli spettri potevano essere mediati per ottenere un migliore spettro di rapporto segnale-rumore. Le fasi più critiche sono la preparazione del diltuion delle nanoparticelle, la pellettizzazione a temperatura criogenica e la preparazione dei campioni di riferimento standard. Questa procedura può essere applicata ad altre tecniche analitiche di massa, come ICP-MS o HPLC-ICP-MS o altre tecniche spettroscopiche non sincrotroni in grado di essere eseguite forma a temperatura criogenica.

Altre questioni scientifiche possono essere esplorate utilizzando questa procedura, in particolare nei campi della biogeologia, della biochimica e delle scienze ambientali o della ricerca tossicologica. I composti del selenio e le nanoparticelle di selenio possono essere altrettanto ardui per la salute e dovrebbero essere manipolati in un cappuccio chimico dedicato usando guanti, occhiali e una maschera per il viso.