जैविक नमूने उच्च संकल्प एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर क्रायोजेनिक तापमान पर प्रजातियों के लिए तैयारी

इस प्रोटोकॉल को सेलुलर नमूनों के लिए मानकीकृत किया गया है, जिससे विभिन्न सिंक्रोट्रॉन स्थानों पर चलने वाले प्रयोगों की तुलना की जा सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ एक सरल और सीधा वर्कफ़्लो है जो नमूने के रासायनिक एकीकरण के तेज और विश्वसनीय संरक्षण की अनुमति देता है। इस तकनीक के लिए नए व्यक्ति जमे हुए पुनरावृत्त कोशिकाओं को पैलेट करने और क्रायोसैंपल ऑर्डर में सेलुलर पैलेट के तेजी से लोड होने के साथ संघर्ष कर सकते हैं।

क्रायोजेनिक तापमान में एक नमूने का एक सटीक और त्वरित अनलिंक महत्वपूर्ण है। जैसे, एक दृश्य प्रदर्शन यह समझने के लिए एक आवश्यक है कि तकनीक को कैसे किया जाए। सेलेनियम प्रजाति के लिए मानव प्रोस्टेट और डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन सेल छर्रों को तैयार करने के लिए, प्रत्येक सेल लाइन से कोशिकाओं की उचित संख्या को एक लैमिनर प्रवाह हुड में उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम में प्रति स्थिति तीन टी -75 फ्लास्क में बीज दें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि कोशिकाएं 80% confluent न हों।

सेलेनियम उपचार के लिए कैंसर कोशिकाओं को उजागर करने के लिए, पहले sonicate ताजा तैयार नैनोपार्टिकल स्टॉक समाधान कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक अल्ट्रासाउंड पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए क्रमिक रूप से उपयुक्त काम सांद्रता के लिए पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में सेलेनियम nanoparticle समाधान पतला करने से पहले. लैमिनर प्रवाह हुड में, धीरे से कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के पांच मिलीलीटर प्रति धोने के साथ दो बार धोएं और फ्लास्क के नीचे ब्याज के सेलेनियम उपचार के 15 मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक जोड़ने के लिए एक बाँझ 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। फ्लास्क को पूरी तरह से सील किए बिना ढक्कन बंद करें और फ्लास्क को 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से रखें।

संस्कृति माध्यम को धोने और फिर से भरने के बाद सेल छर्रों को तैयार करने के लिए, कोशिकाओं को धीरे से अलग करने के लिए फ्लास्क प्रति एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। फ्लास्क से फंसी किसी भी कोशिकाओं को supernatant में फ्लश करने के लिए माध्यम का उपयोग करें और centrifugation द्वारा विघटित कोशिकाओं को इकट्ठा करें। उपचार के सभी शेष निशान को हटाने और पीबीएस के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए प्रति ट्यूब प्रति ट्यूब पीबीएस के पांच मिलीलीटर में छर्रों को दो बार धोएं।

कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को एक और सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ इकट्ठा करें। फिर एक 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें धीरे से supernatant के सभी को हटाने के लिए और सेल गोली के स्तर के लिए तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के निचले हिस्से डुबकी। ठंड के तुरंत बाद, ट्यूबों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन देवर में स्थानांतरित करें।

उच्च रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए, ब्याज की प्रतिदीप्ति रेखा ऊर्जा के संबंध में ब्रैग स्थितियों में क्रिस्टल विश्लेषक स्पेक्ट्रोमीटर से सभी क्रिस्टल का अनुकूलन करें और एक संदर्भ का उपयोग करें जिसके लिए अवशोषण किनारे की ऊर्जा स्थिति घटना मोनोक्रोमैटिक बीम ऊर्जा को कैलिब्रेट करने के लिए जानी जाती है। जैविक नमूनों के लिए एक तरल हीलियम क्रायोस्टेट में नमूना धारक को स्थानांतरित करें और क्रायोस्टेट को 10 डिग्री केल्विन पर सेट करें, फिर सिंक्रोट्रॉन सुरक्षा नियमों का पालन करते हुए प्रयोगात्मक हच को बंद करें, और विश्लेषण शुरू करें। यहां, प्रारंभिक अवस्था में सेलेनियम के प्रतिनिधि उच्च रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्पेक्ट्रा और पोषक माध्यम के लिए इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं में यह दर्शाता है कि प्रारंभिक सेलेनियम नैनोकणों में सेलेनियम सेलेनियम शून्य और सेल्युलाईट जैसे रूपों दोनों के रूप में मौजूद था।

पीसी 3 कोशिकाओं के साथ बातचीत के बाद, हालांकि, सेलेनियम मुख्य रूप से कोशिकाओं में सेलेनियम शून्य के रूप में मौजूद था, जो कोशिकाओं के भीतर सेलेनियम प्रजातियों के परिवर्तन का प्रदर्शन करता था। लोहे के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी संदर्भ स्पेक्ट्रा लोहे के ऑक्सीकरण राज्य के आधार पर अलग-अलग किनारे की स्थिति प्रदर्शित करता है, जिसमें लोहे की कम प्रजातियां कम ऊर्जा मूल्यों में स्थानांतरित हो जाती हैं। डायटम गोली की एक ही स्थिति पर एकत्र किए गए दो क्रमिक स्पेक्ट्रा समान थे, यह दर्शाता है कि 10 केल्विन पर हीलियम क्रायोस्टेट का उपयोग करते समय बीम क्षति दो अधिग्रहणों के बीच सीमित थी।

इसके अलावा, डायटम गोली के विभिन्न पदों से स्पेक्ट्रा समान थे, यह दर्शाते हुए कि नमूना गोली समरूप थी और स्पेक्ट्रा को बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए औसत किया जा सकता था। सबसे महत्वपूर्ण कदम nanoparticle diltuion की तैयारी, क्रायोजेनिक तापमान पर छर्रों, और मानक संदर्भ नमूनों की तैयारी कर रहे हैं। इस प्रक्रिया को अन्य थोक विश्लेषणात्मक तकनीकों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि आईसीपी-एमएस या एचपीएलसी-आईसीपी-एमएस या अन्य गैर-सिंक्रोट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों को क्रायोजेनिक तापमान पर प्रदर्शन करने में सक्षम है।

इस प्रक्रिया का उपयोग करके अन्य वैज्ञानिक प्रश्नों का पता लगाया जा सकता है, विशेष रूप से जैव-भूविज्ञान के क्षेत्र में, जैव रसायन, और पर्यावरण विज्ञान या विष विज्ञान अनुसंधान। सेलेनियम यौगिकों और सेलेनियम नैनोकणों को आपके स्वास्थ्य के लिए कठिन हो सकता है और दस्ताने, चश्मा और फेस मास्क का उपयोग करके एक समर्पित रासायनिक हुड में हेरफेर किया जाना चाहिए।