Biologiska prover Förberedelse för speciering vid kryogen temperatur med hjälp av högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi

Detta protokoll har standardiserats för cellulära prover, vilket möjliggör jämförelse av experiment som körs på olika synkrotronplatser. Den största fördelen med denna teknik är ett enkelt och enkelt arbetsflöde som möjliggör en snabb och pålitlig bevarande av provets kemiska integration. Individer som är nya för denna teknik kan kämpa med de frusna itererade cellerna som pelleterar och den snabba laddningen av cellpelleten i kryosamletordningen.

En exakt och snabb avlänkning av ett prov i kryogen temperatur är avgörande. Som sådan är en visuell demonstration en viktig faktor för att förstå hur man utför tekniken. För att förbereda human prostata och äggstockscancer cellinjepellets för selen speciering, frö lämpligt antal celler från varje cellinje i tre T-75-kolvar per tillstånd i lämpligt cellodlingsmedium i en laminär flödeshuv och placera kolvarna i 37 grader Celsius och 5% koldioxidcellodlingsinkubator tills cellerna är 80% sammanflytande.

För att utsätta cancercellerna för selenbehandling, först sonikat nyberedda nanopartikel lagerlösningar i ett ultraljud vattenbad i 30 minuter vid rumstemperatur innan seriellt spädning selen nanopartikel lösning i komplett cellodling medium till lämpliga arbetskoncentrationer. Tvätta cellerna försiktigt två gånger med fem milliliter 37 grader Celsius PBS per tvätt i den laminära flödeshuven och använd en steril 25 ml pipett för att försiktigt tillsätta 15 ml av selenbehandlingen av intresse till botten av kolven. Stäng locken utan att helt försegla kolven och placera kolvarna horisontellt i cellodlingsinkubatorn i 24 timmar.

För att förbereda cellpellets efter tvättning och påfyllning av odlingsmediet, använd en cellskrapa per kolv för att försiktigt lossa cellerna. Använd medium för att spola alla celler som sitter fast vid kolven i supernatanten och samla de dissocierade cellerna genom centrifugering. Tvätta pellets två gånger i fem milliliter PBS per rör per tvätt för att ta bort alla återstående spår av behandlingen och återsuspendera cellerna i en milliliter PBS.

Överför cellerna till ett 1,5 ml polypropenrör och samla cellerna med en annan centrifugering. Använd sedan en 200 mikroliterpipett för att försiktigt ta bort all supernatant och kasta den nedre delen av varje 1.5 ml rör i flytande kväve till cellpelletens nivå. Omedelbart efter frysning, överför rören till en flytande kväve dewar för långvarig lagring.

För högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi, optimera alla kristaller från kristallanalysatorspektrometern i Bragg-förhållanden med avseende på fluorescenslinjens energi av intresse och använd en referens för vilken absorptionskantens energiposition är känd för att kalibrera den infallande monokromatiska strålenergin. Överför provhållaren till en flytande heliumkryostat för biologiska prover och ställ in kryostaten till 10 grader Kelvin, stäng sedan experimenthyttan enligt synkrotronsäkerhetsreglerna och börja analysen. Här visar representativa högupplösta röntgenabsorptionsspektroskopispektra av selen i det ursprungliga tillståndet och i celler inkuberade till näringsmedium att selen i de initiala selennanopartiklarna var närvarande som både selen noll och celluliterliknande former.

Efter interaktioner med PC3-cellerna var selen emellertid huvudsakligen närvarande i cellerna som selen noll, vilket visar en förändring av selenarter i cellerna. För järn uppvisar högupplösta röntgenabsorptionsspektroskopireferensspektra distinkta kantpositioner beroende på järnoxidationstillståndet, med reducerade järnarter förskjutna till låga energivärden. Två på varandra följande spektra som samlats in på samma position som en kiselalgspellets var likartade, vilket indikerar att strålskadan var begränsad mellan två förvärv vid användning av en heliumkryostat vid 10 Kelvin.

Dessutom var spektra från olika positioner av kiselalgspelleten identiska, vilket visade att provpelleten var homogen och att spektra kunde beräknas i genomsnitt för att erhålla ett bättre signal-brusförhållandespektrum. De mest kritiska stegen är beredningen av nanopartikeldiiltuionen, pelletering vid kryogen temperatur och beredningen av standardreferensproverna. Denna procedur kan tillämpas på andra bulkanalystekniker, såsom ICP-MS eller HPLC-ICP-MS eller andra icke-synkrotronspektroskopiska tekniker som kan utföras från kryogen temperatur.

Andra vetenskapliga frågor kan utforskas med hjälp av detta förfarande, särskilt inom biogeologi, biokemi och miljövetenskap eller toxikologisk forskning. Selenföreningar och selennanopartiklar kan vara lika svåra för din hälsa och bör manipuleras i en dedikerad kemisk huva med handskar, glasögon och ansiktsmask.