Biology
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फोटोवर्टिबल Dendra2 का उपयोग कर एजिंग सी Elegans में प्रोटीन कारोबार के वीवो क्वांटिफिकेशन में
Chapters
Summary June 13th, 2020
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यहां प्रस्तुत प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर Dendra2 को फ्यूज किया गया है।
Transcript
यह प्रोटोकॉल लाइव और एजिंग सी एलिगेंस में रुचि के प्रोटीन के क्षरण को ट्रैक करने और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है। वीवो और नॉनइनवेसिव तकनीक में डींद्र2 को उज्ज्वल और स्थिर फ्लोरोफोर में बदलने के लिए केवल थोड़ी माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है। विधि स्तनधारी प्रणालियों के साथ-साथ जेब्राफिश के अनुकूल है।
अध्ययन करने के लिए, प्रोटेओस्टैटिस नेटवर्क के साथ-साथ परिवहन और तस्करी के भीतर कारोबार में डाल दिया । ब्लू लाइट लेजर के साथ स्कैनिंग करते समय Dendra2 के अवांछित रूपांतरण को भड़काने के लिए नहीं, और परीक्षण और प्रत्येक प्रणाली और संलयन प्रोटीन के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स और रूपांतरण सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए ध्यान रखना। प्रयोग के लिए वांछित उम्र के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती उम्र से मेल वाले सूत्रकृमि से शुरू करें।
इमेजिंग प्रयोग के दिन, डबल आसुत पानी में 3% एकाग्रता पर सामान्य ग्रेड एगर उठे। जबकि एगर उठे ठंडा हो रहा है, पिघले हुए एग्राम के लगभग 400 माइक्रोलीटर की आकांक्षा को सुविधाजनक बनाने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट टिप की नोक को काट दें। ध्यान से एक साफ ग्लास स्लाइड पर agarose की कुछ बूंदें जोड़ें और तुरंत दो कांच के टुकड़ों के बीच agarose की एक पतली पैड बनाने के लिए बूंदों के शीर्ष पर एक और स्लाइड जगह है ।
जब एगर उठे सूख गए हैं, तो शीर्ष स्लाइड को ध्यान से हटा दें। जब पर्याप्त स्लाइड तैयार हो गए हों, तो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें और उत्तेजन और उत्सर्जन के लिए प्रकाश पथ निर्धारित करें। हरे रंग के Dendra2 के लिए 553 नैनोमीटर के लिए 486 जोड़ें, और लाल Dendra2 के लिए 580 से 740 नैनोमीटर जोड़ें।
फ्लोरोफोर की तीव्रता के अनुसार दोनों चैनलों की शक्ति और लाभ को समायोजित करें और पिनहोल को पूरी तरह से खोलने के लिए सेट करें। एक अनुक्रमिक चैनल मोड का चयन करें और हर फ्रेम स्विच करने के लिए ट्रैक सेट करें। एक के एक लाइन चरण के साथ 1024 तक फ्रेम और फ्रेम आकार के रूप में स्कैन मोड सेट करें।
औसत को दो से सेट करें और औसत विधि और एकदिशात्मक रेखा के मोड से औसत करें। आठ बिट्स के लिए थोड़ा गहराई सेट करें। Dendra2 के रूपांतरण के लिए बहुआयामी अधिग्रहण सेटिंग को परिभाषित करें।
कन्वर्जन और ब्लीचिंग के लिए 405 नैनोमीटर डायोड लेजर सेट टू 60% एनर्जी पावर का इस्तेमाल करें। चक्र और एक सामान्य शुरुआत और स्टॉप के बीच 0.0 मिलीसेकंड अंतराल के साथ दो चक्रों की एक समय श्रृंखला का चयन करें। दो में से एक को स्कैन करने के बाद शुरू करने के लिए ब्लीचिंग सेट करें, 30 पुनरावृत्तियों के लिए दोहराने के लिए और जब तीव्रता 50% तक गिर जाती है तो, अधिग्रहण पिक्सेल की गति को परिभाषित करने के लिए रूपांतरण के लिए तेजी से और एक तस्वीर छवि पर कब्जा करने के लिए माध्यम के लिए रहते हैं।
स्लाइड पर सूत्रकृमि माउंट करने के लिए, प्रत्येक स्लाइड पर एग्राजिंग पैड के विपरीत चार वर्गों के साथ एक खिड़की को आकर्षित करने और नंबर करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें। एगर उठे पैड के बीच में लेविमिसोल के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें और बूंद में उम्र से मेल खाने वाले नेमाटोड के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक तार लेने का उपयोग करें। प्रत्येक सूत्रकृमि को वर्ग की एक खिड़की में धीरे-धीरे स्थानांतरित करने के लिए एक बरौनी पिक का उपयोग करें।
जब सभी सूत्रकृमि को फिर से तैनात किया गया है, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कीड़े ने इमेजिंग के दौरान सूत्रकृमि को स्थिर करने के लिए तरल पर कवर स्लिप रखने से पहले आगे बढ़ना बंद कर दिया है। फिर, स्लाइड को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। ग्रीन Dendra2 रूपांतरण के लिए, पहले सूत्रकृमि का पता लगाने और सिर या पूंछ पर ध्यान केंद्रित करने के लिए हरे रंग की फ्लोरेसेंस के तहत 20 एक्स उद्देश्य के आईपीस का उपयोग करें।
कॉन्फोकल मोड पर स्विच करें और संतृप्त छवि प्राप्त करने के लिए लाभ और लेजर शक्ति को बढ़ाएं या कम करें, लेकिन अधिक उजागर छवि नहीं। चयनित न्यूरॉन के आसपास ब्याज का एक क्षेत्र ड्रा और पूंछ है कि ब्याज का पहला क्षेत्र भी शामिल है चारों ओर ब्याज की एक दूसरी बड़ी क्षेत्र आकर्षित । अधिग्रहीत, प्रक्षालित और विश्लेषण करने के लिए पहला क्षेत्र सेट करें।
ब्याज के दूसरे क्षेत्र को अधिग्रहीत और विश्लेषण करने के लिए सेट करें, लेकिन प्रक्षालित नहीं। स्कैनिंग की गति को अधिकतम करने के लिए सेट करें और चयनित Dendra2 न्यूरॉन्स को बदलने के लिए स्कैन शुरू करें। रूपांतरण के तुरंत बाद, लाल चैनल में Dendra2 कल्पना करने के लिए हरे रंग की 561 नैनोमीटर लेजर के साथ लाइव स्कैनिंग शुरू करें और परिवर्तित न्यूरॉन का फोकस और संबंधित अधिकतम प्रक्षेपण ढूंढें।
जल्दी से एक कम पिक्सेल निवास गति के लिए स्कैन दर निर्धारित करते हैं और एक उच्च संकल्प पर दोनों चैनलों की एक स्नैपशॉट छवि प्राप्त करते हैं। इस छवि को रूपांतरण के बाद शून्य समय पर माना जाता है। फिर, स्कैन को पहचाने जाने योग्य नाम और या संख्या के साथ सहेजें, इसके बाद समय शून्य लेबल।
समय के साथ Dendra2 गिरावट को ट्रैक करने के लिए, संबंधित सूत्रकृमि न्यूरॉन के समय शून्य छवि को खोलें। एक ही छवि सेटिंग का उपयोग करना, लाल चैनल में लाइव स्कैनिंग शुरू और ध्यान में परिवर्तित लाल न्यूरॉन लाने के लिए। फिर, किसी भी अधिग्रहण मापदंडों को बदले बिना, पहली छवि के समान गति से एक स्नैपशॉट प्राप्त करें।
Dendra2 को कुशलतापूर्वक और पर्याप्त रूप से परिवर्तित करने और विभिन्न समय बिंदुओं पर समान अधिग्रहण मापदंडों को बनाए रखने के लिए अपनी रूपांतरण सेटिंग को सावधानीपूर्वक परिभाषित करना सुनिश्चित करें। परिवर्तित Dendra2 छवियों का विश्लेषण करने के लिए, फिजी में समय शून्य और दूसरी बार बिंदु छवियों को खोलें और विश्लेषण और सेट मापन खोलें। क्षेत्र और एकीकृत घनत्व कार्यों का चयन करें और लाल चैनल के साथ प्राप्त छवि का चयन करें।
बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करना, शून्य परिवर्तित न्यूरॉन के समय के आसपास रुचि का एक क्षेत्र आकर्षित करें। न्यूरॉन की रूपरेखा को ठीक से पहचानने के लिए, तीव्रता सीमा को उजागर करने के लिए छवि, समायोजित और सीमा का चयन करें। एक बार चयन परिभाषित किया गया है, विश्लेषण और उपाय पर क्लिक करें ।
एक पॉप अप परिणाम विंडो दिखाई देगी, जिसमें रुचि के चयनित क्षेत्र के लिए क्षेत्र, एकीकृत घनत्व और कच्चे एकीकृत घनत्व मूल्य शामिल हैं। दूसरी बार बिंदु से छवि के लिए चयन और माप की एक ही प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं। फिर, मूल्यों को स्प्रेडशीट में कॉपी करें।
रूपांतरण से पहले इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, जब नमूना लाल चैनल में उत्साहित था तो कोई लाल संकेत दिखाई नहीं दे रहा था। विकिरण पर, ग्रीन सिग्नल कम हो गया क्योंकि एचटीटी-डी2 को परिवर्तित कर दिया गया था और बाद में एक लाल संकेत दिखाई दिया। HTT-D2 अभिव्यक्ति समय के साथ अपमानित, लाल HTT-D2 संकेत के स्तर में कमी और अधिक संलयन प्रोटीन के रूप में हरी HTT-D2 संकेत की एक संभावित वृद्धि के परिणामस्वरूप नए संश्लेषित किया गया ।
विशेष रूप से, पूंछ क्षेत्र के न्यूरॉन्स सिर के उन लोगों की तुलना में काफी अधिक सक्रिय होने के लिए निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, रूपांतरण के 24 घंटे बाद नियंत्रण HTTQ25-D2 का काफी अधिक क्षरण हुआ, फिर सिर और पूंछ न्यूरॉन्स दोनों में दो घंटे के बाद। यह अंतर रोगजनक HTTQ97-D2 में नहीं देखा गया था, हालांकि, सुझाव है कि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क एचटीटी-डी 2 को हटाने में असमर्थ था जिसमें तंत्रिका तंत्र में लंबे समय तक ग्लूटामाइन फैला हुआ था।
HTTQ97-D2 को बहुत पुराने सूत्रकृमि में एचटीक्यू25-डी 2 के रूप में कुशलता से अपमानित नहीं किया गया था, जो पुराने जानवरों में हंटिंगटिन की एकत्रित और संभवतः विषाक्त प्रजातियों को हटाने के लिए प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क की असमर्थता को रेखांकित करता था। महत्वपूर्ण बात, पूंछ न्यूरॉन्स युवा सूत्रकृमि में विषाक्त HTTQ97-D2 के साथ सामना करने में सक्षम थे, सुझाव है कि विभिन्न सहवर्ती प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क तंत्र काम पर हो सकता है HTT-D2 को दूर करने के लिए । प्रत्येक नमूने के अधिग्रहण और गैर-अतिउपशोर और गैर-संतृप्त छवि के लिए रूपांतरण के तुरंत बाद और उस नमूने के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग समय भर में करें।
इस प्रोटोकॉल के साथ, रोग से जुड़े प्रोटीन के प्रसार को ट्रैक करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी की मदद से, एक प्रोटेओस्टैटिस नेटवर्क में परिवर्तनों का परीक्षण करना संभव है।
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