Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Indringende mRNA Kinetics in ruimte en tijd in Escherichia coli met behulp van Two-Color Single-Molecule Fluorescentie in Situ Hybridisatie
Chapters
Summary July 30th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft een toepassing van fluorescentie met één molecuul in situ hybridisatie (smFISH) om de in vivo kinetiek van mRNA-synthese en -afbraak te meten.
Transcript
smFISH staat bekend om het meten van het absolute aantal als sub cellulaire locatie van mRNAs. Onze twee kleuren sMFISH protocol heeft de toegevoegde mogelijkheid van het meten van de kinetiek van transcriptie en mRNA afbraak. Met behulp van deze methode kunnen veel monsters tegelijkertijd worden verwerkt zonder extra tijd of moeite.
Zo kunnen vier keerloopexperimenten die 48 monsters opleveren, in acht uur worden verwerkt voor beeldvorming. Ons protocol is breed toepasbaar voor vele genen en bacteriesoorten. Om afdekslipjes en glazen glijbanen voor te bereiden op het experiment.
Gebruik tangen om deklips en glijbanen in een Coplin-pot met 100% ethanol te plaatsen en plaats de pot in een ultrasone waterbad voor 15 tot 20 minuten. Aan het einde van de sonicatie wassen de dia's en deksel glijdt drie tot vier keer met ultra zuiver water voor het bijvullen van de pot met 70%ethanol en het herhalen van de sonicatie. Wanneer alle sonicatiestappen zijn gedaan, droogt de dekking uit en glijdt met stikstofgas.
Plaats de deksel glijdt in een lege 1000 microliter pipet tip box en plaats de glijbanen in een schone schuifdoos. Dan, na de gaten van de pipet tip box gebruik maken van een hydrofobe marker om cirkels te trekken op de cover slips en breng een 20 microliter druppel van 0,1% Poly l lysine op elk van deze putten. Om het opzetten van een tijd cursus experiment, voeg 750 microliter van een 20 milliliter exponentieel groeiende E.coli cultuur aan een 1,5 milliliter cultuur buis gemarkeerd tijd nul.
En onmiddellijk de buis omkeren. Induceer lac Z expressie met 0,2 tot een millimolar IPTG en start een timer. Na het controleren van de timer, het verzamelen van de celcultuur op elk opeenvolgend experimenteel tijdstip, zoals net aangetoond.
Voeg tijdens het experiment tijdens het experiment vijf millimolar ONPF toe aan de kolf om de lac Z-expressie te onderdrukken en blijf de culturen bemonsteren om de mRNA-afbraak bij te houden. Aan het einde van de tijd cursus monster verwerving, incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, gevolgd door incubatie op ijs gedurende 30 minuten. Aan het einde van de incubatiecentrifugeren de monsters om de fixatieve te verwijderen en gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen.
Stel de bacteriën opnieuw op in een milliliter DEPC PBS en was de cellen nog twee keer in één milliliter verse DEPC PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten van de cellen in 30 microliter van verse DEPC PBS. Voor permeabilisatie van de cellen.
Voeg eerst het monster van elk keer punt aan individuele hydrofobe putten op een van de ethanol gesteriliseerde glazen deksel slips. En laat de cellen zich hechten aan de afdeksel met een 10 tot 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 15 microliter van 70% ethanol toe aan elke put.
Na vier minuten, aspirate de ethanol uit elke put, zodat de putten volledig droog zijn. Voeg na het wassen 30 microliter pre-hybridisatieoplossing toe aan elke put van permeabiliseerde cellen en broed de cellen gedurende 30 minuten in een oven van 37 graden Celsius. Vervang de pre hybridisatieoplossing door ongeveer 30 microliters sondehybrideoplossing per put.
En bedek de kamer met aluminiumfolie voor een twee uur durende incubatie in de 37 graden Celsius oven. Gebruik aan het einde van de incubatie een multi-channel pipet om de putten drie tot vijf keer te spoelen met 30 microliters wasoplossing per put per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, incubeer de cellen gedurende 15 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius voor het wassen van de putten vijf keer met 30 microliters van verse DEPC PBS per wasbeurt.
Na de laatste wasbeurt, aspirate alle vloeistof uit de cover slip. En voeg vier microliters van verse DEPC PBS aan elke put. Gebruik tangen om de afdekking voorzichtig op een ethanol gesteriliseerd glas schuifmonster naar beneden, en gebruik siliconen tandvlees om de randen van de cover slip afdichting.
Als u een interessegebied wilt vinden, selecteert u de live-modus van fasecontrastbeeldvorming en manoeuvreert u de werkbare joystick om het gezichtsveld binnen een put te wijzigen. Plaats een gebied waarin de celdichtheid optimaal is en pas de Z-focus zodanig aan dat de fasecontrastcelbeelden scherp zijn. Verwerf vervolgens een C vijf-beeld met een belichting van vier seconden, een C-afbeelding met een belichting van twee seconden en een fasecontrastbeeld met een belichting van 0,2 seconde voor ongeveer 10 verschillende gebieden per put.
Als alternatief kan een NDI-acquisitie worden uitgevoerd waarbij C vijf-, C-drie- en fasecontrastafbeeldingen in serie worden verworven. Wanneer alle putten zijn afgebeeld, opent u een geschikt celsegmentatiegereedschap en u de stapel losklikken. Laad de fasecontrastafbeeldingen van interesse en selecteer onafhankelijke frames en klik op rekenfaseprofiel als nul.
Om te beginnen met het segmentatieproces waarin de cellen worden geïdentificeerd en hun contouren worden berekend. Laad de parameters in de Map GitHub en klik op alle frames. Aan het einde van de verwerking selecteer contour om het net te visualiseren.
Vervolgens, onder de spot detectie tabblad, uitchecken stapel, controleer mazen en klik wrijven om te beginnen met de spot identificatie en kwantificering op basis van de twee D Gaussian montage. Selecteer de map met de fluorescerende afbeeldingen en het netbestand dat zojuist is berekend op basis van de celdetectieprocedure en geef de bestandsnaam aan waarop de resultaten van de spotdetectie worden opgeslagen. Gebruik vervolgens de werkstroom voor beeldanalyse op GitHub om de fluorescentiebeelden te analyseren.
In dit volledige gezichtsveld kunnen ongeveer 500 E.coli cellen met een goede dichtheid voor celsegmentatie worden waargenomen. De morfologie van de cellen in de fasecontrastbeelden moet voor segmentatiedoeleinden vergelijkbaar blijven met die van levende cellen. Als de cellen meer dan permeabiliseerd zijn, zal hun morfologie ongeschikt worden voor segmentatie.
De verdeling van lac Z mRNA spot intensiteiten voor inductie past niet goed bij een normale of Poisson verdeling als gevolg van de aanwezigheid van vlekken met hoge intensiteiten. Wanneer de expressie van lac Z wordt geïnduceerd neemt het signaal van vijf prime lac Z mRNA toe voordat het drievoudige lac Z mRNA-signaal toeneemt. Als de expressie van lac Z wordt onderdrukt zowel de vijf en drie prime lac Z mRNA signalen afnemen.
Om de snelheid van transcriptieverlenging te verkrijgen, zijn de opkomst van de vijf en drie priemsignalen geschikt voor lijnen. Terwijl de snelheid van mRNA afbraak wordt verkregen door het monteren van het verval gebied met een exponentiële functie. Omdat single molecule vis is een eencellige techniek, cel tot cel variabiliteiten in transcriptie kan ook worden geanalyseerd.
Bovendien maakt de analyse van de colocalisatie van vijf priemgezftigde en drie priemgez mRNA het mogelijk om de dichtheid van de RNA-polymerasen op het lac Z-gen te kwantificeren. Als monsters uit verschillende tijdpunten gelijktijdig worden behandeld tijdens deze procedure. Het is belangrijk om het monster gescheiden te houden terwijl ze in de buizen en op de dek slip.
Met behulp van deze single molecule eencellige microscopie techniek. Onderzoekers kunnen nu onderzoeken hoe transcriptie en mRNA afbraak kinetiek zijn gerelateerd aan de absolute aantallen of subcellulaire locaties van mRNAs.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
