Login processing...

JoVE Journal
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Organisk løsemiddelbasert proteinutfelling for robust proteomrensing før massespektrometri

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Journal (Chemistry)

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Journal (Chemistry)

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Click here for the English version

Organisk løsemiddelbasert proteinutfelling for robust proteomrensing før massespektrometri

Article DOI: 10.3791/63503-v

February 7th, 2022 •

Jessica L. Nickerson¹, Venus Baghalabadi¹, Ziheng Dang¹, Victoria A. Miller², Sara L. Little², Alan A. Doucette¹

¹Department of Chemistry, Dalhousie University, ²Proteoform Scientific Inc.

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 7th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokollen beskriver løsningsmiddelbasert proteinutfelling under kontrollerte forhold for robust og rask gjenvinning og rensing av proteomprøver før massespektrometri.

Transcript

Disse protokollene er utformet for å maksimere utvinningen så vel som renheten av proteiner gjennom løsningsmiddelbasert utfelling. Vi skal vise deg et par triks for å utføre nedbør i hetteglass, samt en halvautomatisk tilnærming i et spinnpatronformat. Vi har også optimalisert nedbørsprotokollen for å være konsistent og rask.

Hele protokollen tar bare noen få minutter. Disse protokollene viser at løsningsmiddelutfelling av proteiner er ideell for prøvepreparering foran massespektrometri. Protokollene vil passe sømløst inn i bottom up så vel som ovenfra og ned pro arbeidsflyter.

Demonstrere for oss i dag vil være Ziheng Dang og Victoria Miller, seniorforsker ved Proteoform Scientific i Halifax, Nova Scotia Pipette 90 mikroliter partikkelfri proteinløsning i et polypropylen mikrosentrifugerør. Tilsett deretter 10 mikroliter av en mol vandig natriumklorid og 400 mikroliter aceton i prøveløsningen, lokk og trykk forsiktig på hetteglasset for å kombinere løsningsmidlene. La hetteglasset inkubere det.

Romtemperatur uforstyrret i minst to minutter etter inkubasjon, sentrifuger prøvene som noterer orienteringen av hetteglasset og spinner i minst to minutter ved 10.000 RCF eller høyere ved romtemperatur. Etter sentrifugering observeres en synlig hvit pellet på bunnen av røret. På dette punktet, løsne røret og dekanter supernaten i en avfallsbeholder ved å invertere røret.

Bruk et papirhåndkle til å trekke opp gjenværende oppløsningsvæske fra hetteglasset. For SDS som inneholder prøver. Dispenser forsiktig 400 mikroliter fersk aceton uten å forstyrre pelleten.

Sentreng prøven umiddelbart i ett minutt ved 10 000 ganger G eller høyere ved romtemperatur ved å plassere hetteglasset i rotoren i samme retning som det første spinnet. Tell oppløsningsvæsken opp som beskrevet tidligere. Tørk prøven med hetten åpen i omtrent ett minutt.

I en avtrekkshette, før en pelletsoppløseliggjøring. Dispenser 100 mikroliter av proteinoppløsningen i et hetteglass av polypropylen. I avtrekkshetten, tilsett en 400 mikroliter metanol etterfulgt av 100 mikroliter kloroform.

Sett lokk hetteglasset og virvelen kort for å blande. Dispenser raskt 300 mikroliter vann direkte inn i midten av hetteglasset. Sett på lokk hetteglasset og la det stå uforstyrret på benken i ett minutt, etter at hetteglasset med polypropylen er plassert i en sentrifuge og spinn det i fem minutter ved 10 000 ganger G eller høyere ved romtemperatur.

Hetteglasset observeres å ha to lag med oppløsningsvæske og en synlig hvit pellet til hetteglasset ved ca. 45 grader. Fjern ca. 700 mikroliter av oppløsningsvæsken fra det øvre laget med jevn hastighet ved hjelp av en stor pipettespiss på en milliliter mikro først og senere med en pipettespiss på 200 mikroliter til den danner en perle i hetteglasset. Tilsett 400 mikroliter fersk metanol i prøveflasken uten å forstyrre pelleten ved å dispensere oppløsningsvæsken ned på siden av hetteglasset.

Sett lokk hetteglasset og kombiner lagene med oppløsningsvæske ved å vippe hetteglasset forsiktig for å virvle oppløsningsvæskene sammen. For å observere den hvite proteinpelleten som noterer orienteringen av hetteglasset i rotorsentrifugen i minst 10 minutter ved 10.000 ganger G eller høyere ved romtemperatur. Vinkel hetteglasset med pelleten vendt nedover.

Plasser en pipettespiss langs øvre kant av hetteglasset og fjern supernatanten med en mikroliter mikropipettespiss i langsom, men jevn hastighet. Beholder ca. 20 mikroliter løsningsmiddel. La det gjenværende løsningsmidlet tørke i avtrekkshetten.

Å utfelle proteinet. Bruk en engangsfiltreringspatron til å feste pluggen til den øvre filtreringspatronen. Kombiner 90 mikroliter proteinoppløsning 10 mikroliter av en mol aquas, natriumklorid og 400 mikroliter aceton.

Inkuber i minst to minutter på benken, sentrifuger den tilberedte proteinprøven med pluggen fortsatt festet til filtreringspatronen i to minutter ved 2.500 ganger G.At romtemperatur, snu patronen og skru av og fjern pluggen fra patronbunnen. Plasser filtreringspatronen i et rent hetteglass som sentrifugerer proteinprøven i tre minutter ved 500 ganger G ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningen gjennom oppløsningsvæsken fra det nedre hetteglasset.

Vask proteinpelleten ved å tilsette 400 mikroliter aceton til filtreringspatronen, sentrifuger i tre minutter ved 500 ganger G ved romtemperatur eller til det ikke er noe løsningsmiddel igjen i den øvre patronen. Etter de tidligere demonstrerte proteinutfellingsprotokollene. Resolubiliser proteinet ved å fukte membranen ved foten av filtreringspatronen ved å dispensere to til fem mikroliter ISO-propanol direkte til membranen umiddelbart før du fortsetter til reoppløseligiseringsprotokollen for reoppløseligisering av proteinpelleten, lag 80% volumvis oppløsning av maursyre i vann.

Avkjøl denne syreoppløsningen ved minus 20 grader Celsius og filtreringspatronen som inneholder utfelt protein. Dispenser 50 mikroliter kald fortynnet maursyre i den kjølte patronhetten og virvelen i 30 sekunder. Sett filtreringspatronen tilbake i fryseren ved minus 20 grader Celsius i 10 minutter.

Gjenta de forrige virvel- og inkubasjonstrinnene. Tilsett 450 mikroliter vann til et endelig volum på 500 mikroliter. Fortynn maursyren til 8 %Skru av sylinderampullen og fjern støpselet fra sylinderampullebunnen og fest SPE-sylinderampullen til hetteglasset.

Spinn proteinet gjennom SPE-sylinderampullen i en sentrifuge ved romtemperatur i fem minutter ved 800 ganger G.Hvis oppløsningsvæsken forblir i den øvre sylinderampullen, returner sylinderampullen til sentrifugen og gjenta spinnet. Skyll ved å tilsette 300 mikroliter 5% acetonitril med 0,1% TFA i vann til SPE-patronen, flyt gjennom SPE-patronen i to minutter ved 2000 ganger G.For proteiner med lav molekylvekt eller fordøyede peptider eluerer prøven ved å strømme 300 mikroliter. En 50% acetonitril med 0,1% TFA i fem minutter ved 2, 500 ganger G.For intakte proteiner.

Følg opp med et ekstra unnvikelsestrinn ved bruk av 300 mikroliter 75% acetonitril med 0,1% Trifluoro-asketisk syre. Kombiner de to resulterende ekstraktene. Figuren sammenligner SDS-uttømming etter hetteglassbasert eller utfelling av proteiner i en engangsfilterpatron.

Bruke aceton med de konvensjonelle hurtig- og CMW-protokollene. Alle tilnærminger reduserer SDS for å muliggjøre optimal massespektrometrianalyse. Denne figuren viser kvantitativ proteinutvinning ved å følge rask acetonutfelling og CMW-utfelling gjennom SDS-sideanalyse av et bearbeidet gjær totalt cellelysat.

Konsekvent utvinning ble oppnådd med alle nedbørsprotokoller. Utfelling i en engangsfiltreringspatron eliminerer behovet for å forsiktig pipette SDS som inneholder supernatant mens du beholder de aggregerte proteinene over et membranfilter. Dermed ble det ikke påvist synlige bånd i supernatantfraksjonene over tre uavhengige replikasjoner.

Den patronbaserte proteinutfellingen viser overlegen gjenvinning av en Pepsin-fordøyd prøve av bovint plasma i forhold til hetteglassbasert utfelling. Mer signifikante forskjeller i utbytte er notert i patronen ved bruk av natriumklorid mens bruk av sinkløsningsmiddel resulterte i det høyeste utbyttet. Denne figuren kvantifiserer maksimal peptidintensitet fra hver peptidprøve med et forhold over en som reflekterer en høyere peptidmengde for prøver behandlet i engangsfilterpatronene.

Figuren sammenligner antall identifiserte peptider per protein på tvers av de tre replikasjonsprøvepreparatene. Korrelasjonskoeffisientene på 0,94 til 0,95 i disse grafene viser den høye konsistensen av prøveprepareringsmetoden for bottom up massespektrometrianalyse. Så når pelleten er dannet, vil du virkelig unngå å forstyrre den.

Hvis du holder den som en intakt pellet, får du et høyere utbytte. Så sørg for ikke å glemme å vaske pelleten med ekstra aceton. Dette sørger for at vi blir kvitt SDS som holder prøven vår så ren som mulig, og det gir oss den beste massespektrometrianalysen.

Så vi fant ut at fjerning av overflødig løsningsmiddel ved å invertere er mye enklere enn å prøve å pipette prøven. Du får mer konsistente utbytter på denne måten. Utfelling av aceton ved romtemperatur resulterte i mer konsistent og raskere gjenvinning enn tradisjonell nedbør i fryseren.

X

Simple Hit Counter