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通过质谱学研究蛋白质高阶结构，与二乙基碳酸酯共价标签
Summary June 15th, 2021
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介绍了在质谱检测中进行基于二乙基碳酸酯的共价贴标的实验程序。二甲基碳酸酯只是与感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物混合，导致溶剂可获取氨基酸残留物的修饰。经蛋白解消化和液相色谱/质谱分析后，可识别修改后的残留物。
Transcript
蛋白质结构的特征对于理解蛋白质结构的功能至关重要。质谱学已成为这一目的的有力工具，特别是对于传统方法难以研究的蛋白质系统。为了研究蛋白质结构，通过质量规范，在将蛋白质结构信息编码到质量的溶液中执行特定的化学反应。
一个特别有效的方法是使用试剂，可共效地修改解决可获取的氨基酸侧链。这些反应导致质量增加，当与蛋白解消化和串联质谱法相结合时，可以用残留水平分辨率进行局部化。在这里，我们描述了与使用二甲基碳酸氢化合物或DEPC相关的协议，作为与质量规格检测相关的共价标签试剂。
DEPC 是一种高度电亲的分子，能够标记平均蛋白质中高达 30% 的残留物，从而提供出色的结构分辨率。DEPC 已与质量规格一起成功使用，以获取许多不同蛋白质的结构信息。首先，在数十微摩尔的浓度范围内准备一种缓冲溶液，以激发您的感兴趣的蛋白质。
我们通常使用 10 毫升 pH 7.4 MOPS 缓冲器。或者，如果原始样品包含具有核嗜血功能组的缓冲器，则现有的蛋白质溶液可以缓冲交换到 MOPS 或其他缓冲区。缓冲区必须没有核嗜血功能组，因为它们会干扰DEPC蛋白反应。
在不同的微管中，在干的甲基三甲基中准备100毫摩尔DEPC的库存溶液。在干血小精中准备库存溶液是防止DEPC水解所必需的。在一个新的微管中，在HPLC级水中准备一个摩尔伊米达佐尔溶液。
在一个新的微管中，混合MOPS缓冲器和蛋白质溶液。在蛋白质和缓冲液中加入DEPC库存溶液的别名，确保它正确混合，然后将反应混合物放入37摄氏度的水浴中一分钟。应根据所需的最终 DEPC 蛋白质浓度比率选择所使用的 DEPC 库存解决方案的体积。
没有一组DEPC和蛋白质浓度可以与每种蛋白质配合使用，但可以根据蛋白质中存在的溶剂可获取的组胺和赖氨酸残留物的数量来估计最佳的DEPC浓度。需要注意的是，添加的甲基三甲基三甲基的体积，实际上是添加的DEPC溶液的体积不应超过总反应量的1%，以避免反应过程中蛋白质结构的扰动。反应时间最终由用户决定，尽管在示例条件下，一分钟的反应将 DEPC 的蛋白质和水解标签最小化。
一分钟后，通过添加伊米达佐尔来清除反应 DEPC 上的剩余区域来平息反应。确保伊米达佐尔的最终浓度是DEPC浓度的50倍。为了识别DEPC修改的残留物，蛋白质必须蛋白解体消化成肽碎片。
对于消化，选择适合感兴趣的蛋白质的条件。这里描述的常见步骤包括展开蛋白质，然后减少和碱化脱硫键，以便提高消化效率。根据我们的经验，在消化前用变性和热量展开蛋白质可提高消化效率。
在开发蛋白质时，在适当的消化缓冲中比较 TCEP 和碘乙酰胺的溶液。TCEP 应用作减少剂，而不是二恶英或 DTT，因为 DTT 可以与 DEPC 修改后的残留物发生反应。减少后生成文件的烷基化对于避免标签混乱（其中免费文件和蛋白质与改性氨基酸发生反应）至关重要。
展开步骤完成后，通过在反应混合物中加入 TCEP 来减少脱硫键，并让它在室温下反应三分钟。减少后，在反应混合物中加入碘乙酰胺，让它在黑暗中的室温下反应30分钟。通过将反应混合物放入一个盒子中来实现。
碘乙酰胺的最终浓度应是TCEP浓度的两倍或蛋白质浓度或脱硫键的80倍。根据制造商的规格准备感兴趣的酶，通常尝试普辛或奇莫特普辛。在准备了选择的酶后，开始消化，并在37摄氏度下孵育反应混合物。
使用固定酶进行三小时消化的 10：1 蛋白质与酶的比例通常是 DEPC 标记蛋白质的一个不错的选择。消化后，样品应立即通过LC-MS/MS分析，或用液氮冷冻，以尽量减少样品的降解和标签损失。自下而上的蛋白质组学标准LC-MS/MS参数可用于识别蛋白质解肽片段上的标记位点。
反向阶段C18静止阶段应用于实现肽的最佳分离。根据我们的经验，毛细金LC提供比纳米LC更可靠的修改水平定量信息，因为使用的样品量较高。用于分离DEPC标记肽的典型LC移动相由两种溶剂组成。
溶剂A是0.1%的甲酸水，溶剂B是乙酮三甲酸，0.1%为甲酸。使用梯度弹性，可根据样品的复杂性优化分离时间。需要能够进行在线 LC-MS 和 MS/MS 的质谱仪来识别肽上的 DEPC 修改站点。
在我们的实验中，我们成功地使用了几种类型的质谱仪。我们发现，虽然任何能够在LC-MS分析过程中自动执行许多肽MS/MS的质谱仪都应该是合适的，但温度轨道拉普融合提供了极好的结果。在测量之前应正确设置 HPLC 条件和质谱参数。
如果样品已被闪光冻结，应在分析前立即解冻。尽最大努力将样品制备和HPLC注射之间的时间降至最低。将消化的标记蛋白样品加载并注入LC系统，启动LC-MS/MS采集或DEPC标签现场识别和峰值区域定量，存在多种方法。
在瑟莫费舍尔仪器上， excalibur 或蛋白体发现者可能使用。在程序中设置肽识别的适当参数。DEPC 添加和碳水化合物甲基化包括在协助残留物或分配的可变修改中。
用于确定多肽的改性和未修改版本的色谱峰值区域，以确定残留水平修改百分比。带有MS检测的DEPC标签也是描述蛋白质更高阶结构变化的宝贵工具。根据我们的研究，DEPC共价标签可以识别在热应激和氧化应激下发生结构变化的特定蛋白质区域。
在该图中，修改百分比显著变化以蓝色表示，用于标签的减少，红色表示标签的增加，而未显著标记更改的残留物则以淡绿色显示。例如， 在β-2微球蛋白暴露于热应激后，许多在标签范围上显著减少的残留物，N-总站，血清28，组织丁31，血清33，血清55，血清57和赖氨酸58比蛋白质的一侧更接近，这表明蛋白质的这个区域经历确认变化或可能介导聚合。蛋白质暴露于氧化应激后，标签减少的不同残留物，血清11，组蛋白13，赖氨酸19，赖氨酸41，赖氨酸94，来自蛋白质另一阶段的聚类，表明氧化诱导的确认变化发生在其他地方。
这项研究对蛋白质治疗有重要影响，目前，蛋白质治疗是制药市场增长最快的部分。我们小组的其他工作也表明，DEPC共价标记质量规格可以检测和识别强调单克隆抗体治疗的确认变化点。如你所见，与DEPC的共价标签在实验中很容易实现，但可以为蛋白质提供有价值的结构信息。
与X射线晶体学和NMR等技术相比，DEPC标记质量规格提供的结构分辨率适中，但无论其大小或结晶能力如何，几乎任何蛋白质都可获得。DEPC 共价标记质量规格也适用于蛋白质混合物，可以与非常复杂的样品类型，如细胞利萨酸盐和它哈卡特细胞。观看完这段视频后，我们相信您会发现DEPC标签是描述蛋白质结构的有用工具。
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