Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tillverkning av en kristallin nanocellulosa inbäddad agarose biomaterialbläck för benmärgsbaserad mastcellskultur
Chapters
Summary May 11th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll belyser en metod för att snabbt bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC)/agaroskomposit hydrogel biomaterial bläck med mus benmärg-härledda mastceller när det gäller cell livskraft och fenotypiska uttryck av cellytan receptorer, Kit (CD117) och hög affinitet IgE receptor (FcεRI).
Transcript
Detta protokoll erbjuder ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för screen kandidat biomaterial bläck för potentiella cytotoxiska effekter mot känsliga primära och immunceller före komplexa 3D bioprinting experiment. Efter inkubation av immuncellerna på biomaterialbläckkonstruktionerna kan cellerna enkelt hämtas från konstruktionerna genom skonsam tvättning för att utföra cytotoxicitets- eller biomarköranalyser nedströms. Detta protokoll är direkt relevant för vävnadsteknik där biotryckta vävnader som är avsedda för transplantation måste konstrueras av primärceller och biokompatibla biomaterialfärger.
Till att börja med förbereder du en biobläckpatron för installation på INKREDIBLE+3D-bioprintern. Ta först bort de blå ändlocken från den tre milliliter biomaterialbläckpatronen och fäst ett sterilt koniskt bioprintmunstycke med 22 gauge på Luer-låsänden på biobläckpatronen. Anslut lufttrycksrören för skrivhuvud ett eller PH1 till motsatt ände av patronen och sätt in patronen med dess bifogade koniska bioprintmunstycke i den vertikala öppningen på PH1.
Placera sedan patronen ordentligt i PH1 med ett koniskt bioprintmunstycke som sträcker sig under skrivhuvudet. Dra åt skruven på PH1 medurs tills fingret sitter tätt för att låsa biobläckpatronen på plats. Observera att 3D-bioprintingen kan utföras med PH2 tom.
Slå på bioprintern och starta bioprinterprogramvaran på en dator som är ansluten till 3D-bioprintern via en USB 2.0-kabel. I programvaran klickar du på anslutningsknappen för att synkronisera den med 3D-bioprintern. Observera tre alternativ i huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern.
Förbered först bioprint. För det andra, verktygsmenyn. Och för det tredje, statusskärmen.
Välj alternativet förbered bioprint och bläddra sedan nedåt till och välj alternativet hemaxlar. Efter lyckad kalibrering av XYZ-axlarna sänks utskriftsbäddens höjd något och skrivarhuvudena flyttas till ovanför utskriftsbäddens mittpunkt. För att fortsätta med startpunktskalibreringen för bioprinting i 24-brunnsplattor, ta bort en steril 24-välsodlingsplatta från dess förseglade plastfolie och markera en punkt på mitten av brunn D1 på undersidan av plattan med en permanent markör.
Ta bort plåtskyddet och placera 24-brunnsodlingsplattan på tryckbädden med väl D1 placerad längst fram till vänster i tryckbädden. Välj verktygsmenyn på huvudkontrollmenyn och flytta sedan axeln. Flytta skrivarhuvudena i steg om en millimeter längs X- och Y-axlarna tills ph1:s koniska bioprintmunstycke är direkt över pricken som är markerad under brunnen D1. Finjustera vid behov positionen för det koniska bioprintingmunstycket över pricken genom att flytta skrivarhuvudena i steg om 0,1 millimeter.
Registrera X- och Y-koordinaterna för det koniska bioprintingmunstycket direkt över mitten av brunnen D1 enligt 3D-bioprinterns kontrollpanelskärm och markera koordinaterna. Höj sedan utskriftsbädden i steg om en millimeter tills botten av brunnen D1 nästan vidrör det koniska bioprintingmunstycket som är installerat i skrivhuvud ett. Finjustera utskriftsbäddens rörelse i steg om 0,1 millimeter om det behövs.
Välj kalibreringsalternativet Z-axeln på verktygsmenyn och välj och bekräfta kalibreringsalternativet för butiken Z ytterligare. Gå tillbaka till huvudmenyn och välj alternativet förbered bioprint. Rulla nedåt till och välj alternativet kalibrera Z.
Uppdatera den geometriska koden för 24-brunnsplattan eller G-koden med rätt startpunktskoordinater. Öppna den medföljande 24-brunns G-kodfilen på bioprintprogramvaran. Uppdatera X- och Y-koordinaterna på rad ett med de värden som erhållits i tidigare steg och spara filen under ett nytt namn.
Se till att den pneumatiska pumpen är ordentligt ansluten till den bakre luftintagsporten på INKREDIBLE+3D-bioprintern och slå på den. Dra ut den främre styrknappen på höger sida av INKREDIBLE+3D-bioprintern. Se till att de digitala tryckmätare för PH1 och PH2 som finns på bioprinterns framsida avläste var och en nära noll kilopascal.
Vrid långsamt den främre kontrollratten medurs tills trycket som anges på den vänstra mätaren för PH1 når 12 kilopascals. Placera ett vikt vävnadspapper eller en bit vattentät tätningsfilm under den installerade patronens utskriftsmunstycke, var försiktig så att du inte rör utskriftsmunstycket. Välj förbered bioprint på huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern.
Navigera till och välj aktivera PH1. Observera att biobläcket börjar extrudera från utskriftsmunstycket. Öka vid behov extruderingstrycket genom att vrida kontrollvredet medurs tills biobläcket extruderas i en kontinuerlig glödtråd och registrera den nya tryckinställningen.
Välj Stäng av PH1 för att stoppa extrudering av biobläcket. Ta bort silkespapper eller film som innehåller det extruderade biobläcket från tryckbädden och stäng bioprinterdörren. För att utföra 3D-bioprinting av rätlinjära hydrogelsubstrat i ett 24-brunnsplåtformat, välj verktygsmenyn från huvudkontrollmenyn och välj sedan inaktivera SD-utskrift som gör det möjligt för bioprinterprogramvaran att överföra G-kodfiler till 3D-bioprintern för utskrift.
Klicka på laddningsknappen i bioprinter-programvaran och välj den uppdaterade 24-brunnsplattan G-kodfil. På den högra kontrollpanelen i programvaran väljer du fliken förhandsgranskning och klickar på utskriftsknappen för att påbörja bioprinting i brunn D1. När bioprintningen av de rätlinjiga konstruktionerna är klar, täck 24-brunnsplattan med locket och flytta den till ett klass II-biosäkerhetsskåp. Sänk ned varje rätlinjiga konstruktion i två droppar steril 50 millimolar kalciumkloridlösning och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter.
Aspirera försiktigt kalciumkloridlösningen från varje brunn konstruera och skölj en gång i en milliliter av 1X PBS för att avlägsna överskott av kalciumklorid. För att förhindra uttorkning av de bioprintade hydrogelkonstruktionerna, behåll de biotryckta rätlinliniska konstruktionerna i färsk 1X PBS tills de benmärgsbaserade mastcellerna är redo att sås på konstruktionerna. Baserat på de främre och sidospridningsparametrarna för BMMCs analyserade av flödescytometri observerades det att hydrogelsubstratet med den högsta CNC-koncentrationen inte ändrade BMMCs ursprungliga storlek eller granularitet jämfört med BMMCs odlade i avsaknad av CNC-agaros D-mannitol hydrogelsubstrat.
Flöde cytometrisk analys av BMMCs permeabilitet till propidium jodid visade att ingen av de CNC-koncentrationer som testades framkallade någon negativ effekt på BMMC livskraft. CNC-agarossubstratet ökade uttrycket av mastcellsbiomarkörerna vid CNC-koncentrationer större än eller lika med 2,5%Men uttrycksnivåerna för dessa receptorer förblev relativt konsekventa mellan 2,5% och 12,5%CNC vilket tyder på en effekt som är oberoende av koncentrationen av CNC. XTT-analysen visade att den metaboliska aktiviteten hos BMMCs odlade på 3D bioprinted hydrogelställningar förblev relativt konsekventa på cirka 100%över alla testade tidspunkter.
På samma sätt visade LDH-utgåvan och PI-färguteslutningsanalyserna inga betydande förändringar i BMMCs lönsamhet. Den lätthet med vilken mastcellerna kan hämtas gör det möjligt för dem att undersökas av ett brett spektrum av biologiska analyser för att ytterligare studera någon aspekt av deras cellulära funktioner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
