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Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence
Chapters
Summary April 25th, 2021
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Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.
Transcript
Le meilleur principe de la spectroscopie de corrélation de fluorescence, FCS, a été inventé initialement dans les années 70. Dans les années 1990, des améliorations importantes et nombreuses pour FCS ont été établies en combinant avec une microscopie d’appareil confoccal. Depuis lors, FCS a été utilisé pour de nombreuses applications chimiques et de guérison du virus, telles que les interactions moléculaires et l’analyse de l’agrégation des protéines.
L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs. La luminosité de fluorescence sont des particules simples en action des tailles moléculaires expliquées par des propriétés de diffusion. Il est très important dans la mesure des agrégations de protéines, car il peut déterminer les cycles de vie projetés des molécules, mais aussi distinguer l’homo ou l’hétéro polymérisation.
Ici, nous introduisons une procédure pour mesurer la diffusion de la sclérose latérale amyotrophique associée à la protéine de forme agrégée utilisant FCS dans les lysates cellulaires et les cellules vivantes. Préparer un plat en plastique de 100 millimètres de plus en plus neuro2a cellule assis confortablement dans le milieu de croissance normal. Confirmez la confluence cellulaire.
Retirer le milieu. Ajouter 3,5 millilitres de solution Trypsin-EDTA dans le troisième plat de cartouche et les incuber à 37 degrés Celsius pendant une minute. Ajouter un milieu de croissance normal de 9,5 millilitres dans le plat et les suspendre.
La suspension cellulaire est mélangée avec du bleu trypan pour tacher les cellules mortes. Ajouter la suspension à la diapositive de comptage cellulaire. Comptez le nombre de cellules utilisant le compteur cellulaire, ou manuellement.
Vérifiez le numéro de cellule en direct et leur viabilité. Diluer la cellule dans le milieu compté à 1,0 fois 10 à la puissance de 5 par millilitre. Ajouter deux millilitres de suspension cellulaire dans le plat en plastique de 35 millimètres pour la lyse cellulaire ou le plat d’espace de croissance pour la mesure des cellules vivantes.
Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant une journée. Le lendemain, préparez le mélange d’ADN plasmide et de réhésifs transfection. Ajouter le mélange de transfection au milieu compté par cellules et incuber les cellules pendant 24 heures.
Un jour plus tard. Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope de routine. Vous pouvez voir les corps très lumineux ingrédient TDP25 dans les cellules.
La lyse cellulaire doit être effectuée sur le banc biochimique. Retirer le milieu dans le plat. Ajouter deux millilitres de PBS à 25 degrés Celsius pour les laver à feu moyen.
Retirez le PBS. Déposer le plat sur une plaque d’aluminium sur le dessus de la glace concassée. Ajouter immédiatement le tampon de lyse de 200 microlitres dans le plat.
Racler le plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. Récupérer le lysate avec des débris cellulaires non résolus dans un nouveau tube de 1,5 millimètre. Centrifugeuse le lysate à quatre degrés Celsius.
Pour les mesures des cellules vivantes, remplacez le milieu par un milieu frais avant la mesure. Vérifiez l’attachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Vérifiez également l’expression GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Utilisez un système FCS combiné au microscope confocal. Allumez le laser à 488 nanomètres. Stabiliser le système, au moins, pendant 30 minutes.
Configurer le chemin optique. Utilisez un laser de 488 nanomètres pour la lumière instantanée. Utilisez un séparant de faisceau approprié et des mètres dichroïques.
Et aussi, les fusibles de fluorescence. Habituellement, nous utilisons des chambres en verre de couverture pour l’étalonnage et les mesures de solution. Prenez soigneusement la chambre en verre.
Placez la surface vitrée sur le papier de criblage de la lentille. Verser l’étalonnage fcs. Ajoutez également la solution Rhodamine 6G.
Ajouter l’eau ultrapure sur l’objectif. N’utilisez pas l’huile. Placez la chambre sur la scène du microscope.
Déplacez l’étape à la position appropriée. Créez l’ajustement du sténopé et ouvrez l’assistant d’ajustement du sténopé. Surveillez le taux de nombre de photons comme mouvement grossier du sténopé pour la direction x.
La position la plus brillante a été déterminée à juste titre. Ensuite, surveillez le taux de nombre de photons comme un mouvement fin. La position la plus brillante a été déterminée avec succès C’est la position du sténopé pour la direction x.
De la même façon, recherchez la position la plus brillante du sténopé pour y-direction. La position la plus brillante pour y-direction a également été déterminée avec succès. Aggraver la position x et y du sténopé.
Il est préférable d’ajuster la position du sténopé avant la mesure de chaque jour. Lorsque le chemin d’accès est modifié, la position du sténopé doit être ajustée à nouveau. Créez un taux de compt compte et surveillez le taux de comptement du téléphone.
Passer au mode de surveillance CPM. Comptez l’anneau de correction de l’objet que vous avez couru de sorte que la valeur CPM soit la plus élevée. Fermez la fenêtre de taux de compt compte.
Commencez par la mesure de la solution Rhodamine 6G. Une fois la mesure terminée, cliquez sur l’ajustement pour effectuer l’analyse de montage de courbe. Sélectionnez un modèle pour l’ajustement de l’ancienne fonction de corrélation.
Pour Rhodamine 6G, sélectionnez le modèle pour une diffusion tridimensionnelle à composantes 1 avec un état triplet. Réglez l’heure de départ appropriée en déplaçant la ligne rouge. Cliquez sur Fit All, pour commencer le calcul de montage.
Vérifiez l’écart d’ajustement. Assurez-vous que les côtés sont affichés et négatifs, autour de zéro. Vérifiez les valeurs ajustées.
Assurez-vous que le temps de diffusion est à peu près de l’âge de 20 à 30 microsecondes. En outre, le paramètre structurel est de quatre à huit. Ouvrez le panneau d’ajustement et sélectionnez un modèle pour la mesure.
Entrez la même valeur de paramètre structurel dans le modèle pour l’échantillon dans le panneau d’ajustement. Assurez-vous que le type doit être défini comme fixe. Mesure GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire.
Placer le lysate dans la chambre en verre de couverture. Placez le couvercle pour éviter le séchage du lysate. Placez le couvercle de la scène pour un ombrage léger.
Dans le panneau d’acquisition, réglez la puissance laser, le temps de mesure et ses répétitions. Commencez l’acquisition. Un pic a été observé.
Un pic a été observé à nouveau. Le pic indique que des molécules brillantes sont passées à travers le corps de détection. Les pointes indiquent des oligomers solubles ou des agrégats.
Créez un ajustement pour effectuer l’analyse de montage de courbe. Sélectionnez le modèle pour la diffusion tridimensionnelle à 2 composants avec l’état triplet. Définissez l’heure de début appropriée.
Cliquez sur le Fit All. Vérifiez les valeurs ajustées. SOD1-G85R marqué avec la mesure GFP dans une cellule vivante.
Contrairement à la mesure de solution, je recommande d’utiliser l’incubateur de phase de chaleur. Réglez le plat de culture cellulaire sur la scène du microscope. Confirmez la mise au point et la position à l’aide de l’oculaire.
Sélectionnez une cellule de mesure. Zoomez et ajustez la position de la cellule à l’aide d’un mode de balayage rapide. Obtenez l’instantané des cellules en utilisant le mode vitesse de balayage lent.
Sélectionnez une position de mesure FCS à l’aide de l’outil Position. Le réticule indique la position de mesure. Démarrez la mesure.
La légère diminution de l’enregistrement du taux de nombre de photons suggère le photobleaching de GFP. Effectuez le raccord de courbe. Les résultats représentatifs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire sont montrés.
Le graphique supérieur indique un taux de nombre de photons. Là où il y a des flèches, il y a un pic, suggérant des oligomers solubles et des agrégats. Le graphique du milieu représente l’ancienne fonction de corrélation.
La ligne grise montre la fonction de corrélation basse et ancienne. La ligne magenta montre la fonction ajustée. Les lignes pointillées indiquent les heures de début et de fin pour l’ajustement.
Le tableau inférieur indique la valeur ajustée. Ensuite, les résultats représentatifs de SOD1-G85R-GFP dans une cellule vivante sont affichés. Le graphique supérieur représente un enregistrement de notre taux de nombre de photons.
La diminution graduelle du taux enregistré de nombre de photons a été observée, suggérant le photobleaching de la croissance de GFP pour différentes mesures. C’est en raison de la vitesse de diffusion lente dans les cellules vivantes. Le graphique du milieu représente l’ancienne fonction de corrélation de SOD1.
La ligne grise montre la fonction de corrélation basse et ancienne. La ligne magenta montre la fonction ajustée. Les lignes pointillées indiquent les heures de début et de fin avec raccord.
Le tableau inférieur affiche les valeurs ajustées. Ici, nous vous montrons cette procédure pour mesurer la diffusion de chaque cellule associée TDP-25 dans le lysate cellulaire et tout mutant de SOD1 dans les cellules vivantes en utilisant FCS. Les oligomères solubles et l’agrégation dans le lysate cellulaire peuvent souvent être observés comme des pointes ou des éclats.
D’autre part, dans les cellules vivantes, de tels pics sont rarement observés, à l’exception de structures vivantes potentiellement évidentes. Une espèce lentement diffusatrice de SOD1 mutante ajouter une luminosité moyenne pour les particules simples telles que l’homopolymérisation SOD1 à l’intérieur pour nous. La procédure présentée ici est simple et valable.
FCS ne contient aucun rayonnement;état directement dormant. C’est juste ton, et notre.empathie imaginaire.
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