Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBEM) til undersøgelse af dendritiske rygsøjler

Hver neuron i hjernen er forbundet med andre neuronale celler med ca. 7.000 synapser. Bortset fra, at disse synapser i pattedyrshjernen hovedsageligt er placeret på membranens små fremspring kaldet dendritiske rygsøjler. Plasticitet af synapser og dendritiske rygsøjler og lignende, så vigtige hjernefunktioner som læring og hukommelsesprocesser.

Det er vigtigt at bemærke, at kun elektronmikroskopi giver et fuldt indblik i, om en dendritisk rygsøjle har et postsynaptisk input. Forskellige teknikker på dendritiske rygsøjler billeddannelse er tilgængelige. Seriel blok ansigtsscanning elektronmikroskopi giver dog unik mulighed for at afbilde store mængder væv med en høj opløsning.

Seriel blokbaseret scanningselektronmikroskopiteknik kræver en særlig protokol for prøvepræparat, som indebærer stærk kontrast til tungmetaller. Min primære fiksering under perfusion tillod os at bruge de samme hjerner til lettet elektronmikroskopi. Mus blev ofret og perfunderet med en mild primær fikseringsmiddel.

Hjernen blev skåret i halve og en halvkugle blev post fast med immunfluorescens dedikeret fiksativ, kryobeskyttende, skåret ved hjælp af en kryostat og behandles for immunofluorescens undersøgelser. Hvor den anden halvkugle blev post fast med elektron mikroskopi fikseringsmiddel, skåret med vibratome og forberedt til elektron mikroskopi undersøgelser. Hjerneskiver til seriel blokbaseret scanning elektronmikroskopi undersøgelser blev kontrasteret, flad indlejret i harpiks, så en CA1 region af hippocampus blev monteret på stiften og afbildet med den serielle blok-baserede scanning elektron mikroskop.

Den del af protokollen, der er fremhævet i en gul boks, blev vist i videoen. Tag vævet, som er blevet fastgjort og skåret i 100 mikrobiotiske skiver og vask det med kold fosfatbuffer fem gange i tre minutter hver. Forbered en en-til-en blanding af 4%osmium tetroxid og 3%kalium ferrocyanid.

Det endelige produkt bliver brunt. Fordyb prøverne i denne blanding. Placer derefter prøverne på is.

Og fra dette stadie og fremefter er det vigtigt at beskytte dem mod lys. Inkuber dem med blid rysten i en time. I mellemtiden forberede TCH løsning.

Bland 10 milliliter dobbelt destilleret vand og 0,1 gram TCH. Placer den i en ovn, der er indstillet til 60 Celsius i en time. Det er vigtigt at swill løsningen fra tid til anden.

Når du er klar, afkøles den til stuetemperatur. Vask nu prøverne med dobbelt destilleret vand fem gange i tre minutter hver og derefter nedsænke dem i filtreret TCH-opløsning. Skiverne bliver sorte.

Inkuber dem i 20 minutter ved stuetemperatur. Prøverne vaskes med dobbelt destilleret vand fem gange i tre minutter hver og inkuberes med 2%osmium tetroxid i 30 minutter, denne gang ved stuetemperatur. Igen vaskes prøverne med dobbelt destilleret vand fem gange i tre minutter hver og læg dem i filtreret 1% eller amylacetat.

Inkuber dem ved fire grader Celsius natten over. Næste dag, begynde med D-aspartate forberedelse. Blynitrat blandes med aspartisyreopløsning forvarmet til 60 grader Celsius.

Placer blandingen i et vandbad sat til 60 grader Celsius og justere pH til 5,5 med en molar natriumhydroxid. Luk hætteglasset med bly aspartat og lad det stå i 60 grader Celsius i 30 minutter. Løsningen skal være klar.

Hvis det bliver overskyet, skal det kasseres, og der skal forberedes et nyt. I mellemtiden vaskes prøverne med gassen dobbelt destilleret vand fem gange i tre minutter hver og hold dem i ovnen ved 60 grader Celsius i 30 minutter. Prøverne nedsænkes i den frisklavede bly aspartatopløsning og inkuberes i ovnen, der er indstillet til 60 grader Celsius i 20 minutter.

Gør epoxyharpiks klar. Afveje ingredienserne og bland harpiksen godt i mindst 30 minutter, før du tilføjer accelerator DMP 30. Forbered virus med gradueret fortynding af ethanol.

Derefter tages prøverne ud af ovnen og vask dem igen med dobbelt destilleret vand fem gange i tre minutter hver. I mellemtiden blandes harpiksen med 100% ethanol i en-til-en-proportion for at opnå 50%harpiks. Bland det godt.

Derefter dehydreres prøverne i hver fortynding af ethanol i fem minutter. Husk, at prøverne aldrig må tørre helt. Infiltrere prøverne først i 50% harpiks i 30 minutter, næste i 100% harpiks i en time, og derefter igen i en frisk 100% harpiks natten over.

Den næste dag skal du placere prøverne i frisk 100% harpiks i en time og derefter integrere dem mellem fluoropolymerindlejringsplader. Forbered stykker af indlejring ark, som er blevet affedtet med ethanol og lægge glasrutschebaner, som vil blive brugt som støtte. Placer et stykke indlejring ark på et glas dias, sætte en dråbe harpiks på det, derefter overføre prøven omhyggeligt med brug af træpind.

Dæk det med det andet stykke. Prøv at undgå luftbobler. Vær blid, da vævet er meget skrøbeligt.

Placer forsigtigt en anden glasrutsjebane oven på indlejringspladestykket, og hærd prøven i ovnen ved 70 grader Celsius i mindst 48 timer. Adskil lagene og skær et stykke af den indlejrede prøve med et barberblad. Overfør det til paraffin.

Dette vil minimere risikoen for at miste prøven på grund af elektrostatika. Tag en aluminiumsnål, der er blevet affedtet med ethanol. Bland en ledende epoxy godt og bruge en lille mængde af det til at montere prøven til stiften.

Cure ledende epoxy ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Trim hver side af prøveblokken med diamantkniven, og puds derefter blokkens ansigt, indtil vævet udsættes. Jord prøven til stiften ved hjælp af ledende maling og helbrede det.

For at minimere opladningen skal prøverne også ses belagt med et tyndt lag guld eller guldpaladium. Fastgør stiften med prøven i kammeret på det serielle blokbaserede scanningselektronmikroskop. Prøven justeres til kniven, og luk derefter kammeret, og angiv parametrene.

Indsaml en stak billeder. Ved hjælp af den beskrevne metode blev der opnået billeder af musehjernevæv. Det store billede af hippocampus en region blev taget, og billeddannelsen blev sat i midten af stratum radiatum.

En stak billeder blev erhvervet, og objekter af interesse, såsom dendritiske rygsøjler og synapser, blev segmenteret. God kvalitet væv morfologi blev opnået med klart synlige membraner og synaptiske vesikler og velbevarede mitokondrier. Immunfluorescerende undersøgelser af PSD 95 antistof bekræftede, at mild primær fiksering og traditionel fiksering med 4%PFA giver sammenlignelige resultater.

Præsenteret protokol gør det muligt at erhverve hjernevævsbilleder ved hjælp af seriel blokbaseret scanningselektronmikroskopi, vævsmorfologi af høj kvalitet og 12 synlige membraner letter 10 rigtige segmentering og rekonstruktion. Min primære fiksering gjorde det muligt at bruge de samme hjerner til analyse af PSD 95 immunfluorescens og elektronmikroskopi imaging dendritiske rygsøjler. Her bruger vi PSE 9, 500 spirende.

Den anden kan dog også bruges.