Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Cada neurona en el cerebro está conectada con otras células neuronales por aproximadamente 7.000 sinapsis. Excepto que esas sinapsis en el cerebro de los mamíferos se encuentran principalmente en las pequeñas protuberancias de la membrana llamadas espinas dendríticas. Plasticidad de las sinapsis y espinas dendríticas y similares, funciones cerebrales tan importantes como el aprendizaje y los procesos de memoria.

Es importante tener en cuenta que solo la microscopía electrónica da una idea completa de si una columna dendrítica tiene una entrada postsináptica. Hay disponibles varias técnicas de imágenes de espinas dendríticas. Sin embargo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie ofrece una posibilidad única de obtener imágenes de un gran volumen de tejido con una alta resolución.

La técnica de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie requiere un protocolo especial de preparación de muestras que implica un fuerte contraste con metales pesados. Mi fijación primaria durante la perfusión nos permitió usar los mismos cerebros para la microscopía electrónica aligerada. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con un fijador primario suave.

El cerebro se cortó en mitades y un hemisferio se fijó con un fijador dedicado a la inmunofluorescencia, crioprotector, se cortó en rodajas con un criostato y se procesó para estudios de inmunofluorescencia. Donde el otro hemisferio fue fijado con fijador de microscopía electrónica, cortado con el vibrátomo y preparado para estudios de microscopía electrónica. Las rebanadas cerebrales para los estudios de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie se contrastaron, se incrustaron de forma plana en resina, luego se montó una región CA1 del hipocampo en el pasador y se tomaron imágenes con el microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie.

La parte del protocolo resaltada en un cuadro amarillo se presentó en el video. Tome el tejido, que ha sido fijado y cortado en 100 rodajas microbióticas y lávelo con tampón de fosfato frío cinco veces durante tres minutos cada una. Prepare una mezcla uno a uno de tetróxido de osmio al 4% y ferrocianuro de potasio al 3%.

El producto final se volverá marrón. Sumergir las muestras en esta mezcla. Luego coloque las muestras en hielo.

Y a partir de esta etapa es importante protegerlos de la luz. Incubarlos con un suave agitación durante una hora. Mientras tanto, prepare la solución TCH.

Mezclar 10 mililitros de agua destilada doble y 0,1 gramos de TCH. Colóquelo en un horno a 60 grados centígrados durante una hora. Es importante dar la solución de vez en cuando.

Cuando esté listo, enfríelo a temperatura ambiente. Ahora lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y luego sumérjalas en una solución TCH filtrada. Las rodajas se volverán negras.

Incubarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una e incube con tetróxido de osmio al 2% durante 30 minutos, esta vez a temperatura ambiente. Nuevamente, lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y colóquelas en acetato de amilo filtrado al 1%.

Incubarlos a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, comience con la preparación de D-aspartato. Mezcle el nitrato de plomo con la solución de ácido aspártico precalentada a 60 grados centígrados.

Coloque la mezcla en un baño de agua a 60 grados centígrados y ajuste el pH a 5.5 con un hidróxido de sodio molar. Cierre el vial con aspartato de plomo y déjelo en 60 grados centígrados durante 30 minutos. La solución debe ser clara.

Si se vuelve turbio, debe descartarse y se debe preparar uno nuevo. Mientras tanto, lave las muestras con el gas doble agua destilada cinco veces durante tres minutos cada una y manténgalas en el horno a 60 grados centígrados durante 30 minutos. Sumergir las muestras en la solución de aspartato de plomo recién preparada e incubarlas en el horno a 60 grados centígrados durante 20 minutos.

Preparar resina epoxi. Pesar los ingredientes y mezclar bien la resina durante al menos 30 minutos antes de añadir el acelerador DMP 30. Preparar el virus con dilución graduada de etanol.

Luego saque las muestras del horno y lávelas nuevamente con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una. Mientras tanto, mezcle la resina con 100% de etanol en proporción uno a uno para obtener la resina del 50%. Mézclalo bien.

Después de esto, deshidrate las muestras en cada dilución de etanol durante cinco minutos. Recuerde que las muestras nunca deben secarse por completo. Infiltrar las muestras primero en 50% de resina durante 30 minutos, luego en 100% de resina durante una hora, y luego nuevamente en una resina fresca de 100% durante la noche.

Al día siguiente, coloque las muestras en resina fresca 100% durante una hora y luego insértelas entre las láminas de incrustación de fluoropolímeros. Prepare trozos de lámina de incrustación que hayan sido desgrasados con etanol y deje a un lado los portaobjetos de vidrio que se utilizarán como soporte. Coloque un trozo de lámina incrustante en un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de resina sobre él, luego transfiera la muestra con cuidado con el uso de un palo de madera.

Cúbrelo con la segunda pieza. Trate de evitar las burbujas de aire. Sea suave ya que el tejido es muy frágil.

Coloque con cuidado otro portaobjetos de vidrio encima de la pieza de la hoja de incrustación y cure la muestra en el horno a 70 grados centígrados durante al menos 48 horas. Separe las capas y corte un trozo de la muestra incrustada con una cuchilla de afeitar. Transfiéralo a la parafina.

Esto minimizará el peligro de perder la muestra debido a la electrostática. Tome un pasador de aluminio que haya sido desengrasado con etanol. Mezcle bien un epoxi conductor y use una pequeña cantidad de él para montar la muestra en el pasador.

Cure el epoxi conductor a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Recorte cada lado del bloque de muestra con el cuchillo de diamante y luego pula la cara del bloque hasta que el tejido quede expuesto. Moele la muestra al pasador con pintura conductora y cújela.

Para minimizar la carga, las muestras también deben ser manchadas recubiertas con una fina capa de oro o paladio de oro. Coloque el pasador con la muestra en la cámara del microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie. Alinee la muestra con el cuchillo y luego cierre la cámara y establezca los parámetros.

Recopila una pila de imágenes. Utilizando el método descrito, se obtuvieron imágenes de tejido cerebral de ratón. Se tomó la imagen grande del hipocampo en una región y la imagen se colocó en el centro del estrato radiatum.

Se adquirió una pila de imágenes y se segmentaron los objetos de interés, como las espinas dendríticas y las sinapsis. Se obtuvo una morfología tisular de buena calidad con membranas y vesículas sinápticas claramente visibles y mitocondrias bien conservadas. Los estudios inmunofluorescentes de anticuerpos PSD 95 confirmaron que la fijación primaria leve y la fijación tradicional con 4% pfa dan resultados comparables.

El protocolo presentado permite la adquisición de imágenes de tejido cerebral con el uso de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie, morfología tisular de alta calidad y 12 membranas visibles que facilitan la segmentación y reconstrucción correctas de 10. Mi fijación primaria hizo posible utilizar los mismos cerebros para el análisis de la inmunofluorescencia PSD 95 y la microscopía electrónica de imágenes de las espinas dendríticas. Aquí usamos PSE 9, 500 en ciernes.

Sin embargo, el otro también se puede usar.