Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBEM) для исследования дендритных шипов

Каждый нейрон в мозге связан с другими нейронными клетками примерно 7000 синапсами. За исключением того, что эти синапсы в мозге млекопитающих в основном расположены на небольших выступах мембраны, называемых дендритными шипами. Пластичность синапсов и дендритных шипов и т.д., такие важные функции мозга, как процессы обучения и памяти.

Важно отметить, что только электронная микроскопия дает полное представление о том, имеет ли дендритный позвоночник постсинаптический вход. Доступны различные методы визуализации дендритных шипов. Однако последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия дает уникальную возможность получить изображение большого объема ткани с высоким разрешением.

Метод последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии требует специального протокола пробоподготовки, который включает в себя сильное контрастирование с тяжелыми металлами. Моя первичная фиксация во время перфузии позволила нам использовать тот же мозг для осветленной электронной микроскопии. Мышей приносили в жертву и перфузировали мягким первичным фиксатором.

Мозг разрезали на половинки, а одно полушарие постфиксировали иммунофлуоресцентным специальным фиксатором, криопротектором, разрезали с помощью криостата и обрабатывали для иммунофлуоресцентных исследований. Где другое полушарие было постфиксировано с помощью электронной микроскопии фиксатором, разрезано вибратомом и подготовлено для исследований электронной микроскопии. Срезы мозга для серийных блочных сканирующей электронной микроскопии были противопоставлены, плоско встроены в смолу, затем область CA1 гиппокампа была установлена на штырь и визуалирована с помощью последовательного сканирующего электронного микроскопа на основе блоков.

Часть протокола, выделенная в желтом поле, была показана в видео. Возьмите ткань, которая была зафиксирована, и нарежьте на 100 микробиотических ломтиков и промыть ее холодным фосфатным буфером пять раз в течение трех минут каждая. Приготовьте смесь один к одному из 4% тетроксида осмия и 3% ферроцианида калия.

Конечный продукт станет коричневым. Погрузите образцы в эту смесь. Затем поместите образцы на лед.

И с этого этапа важно защищать их от света. Высиживать их с легким встряхиванием в течение одного часа. Тем временем приготовьте раствор ТХ.

Смешайте 10 миллилитра двойной дистиллированной воды и 0,1 грамма ТГ. Поместите его в духовку, установленную при 60 градусах Цельсия, на один час. Важно время от времени взмахивать раствором.

Когда он будет готов, охладите его до комнатной температуры. Теперь промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый, а затем погрузить их в фильтрованный раствор ТП. Срезы почернеют.

Инкубировать их в течение 20 минут при комнатной температуре. Промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый и инкубировать их с 2% тетроксидом осмия в течение 30 минут, на этот раз при комнатной температуре. Опять же, промыть образцы двойной дистиллированной водой пять раз в течение трех минут каждый и поместить их в фильтрованный 1% или амилацетат.

Высиживают их при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день начинают с препарата D-аспартата. Смешайте нитрат свинца с раствором аспарагиновой кислоты, предварительно нагретым до 60 градусов Цельсия.

Поместите смесь на водяную баню, установленную при 60 градусах Цельсия, и отрегулируйте рН до 5,5 с помощью одного молярного гидроксида натрия. Закройте флакон аспартатом свинца и оставьте его при 60 градусах Цельсия на 30 минут. Решение должно быть ясным.

Если он становится мутным, его необходимо выбросить, и нужно подготовить новый. Тем временем промыть образцы газообразной двойной дистиллированной водой пять раз по три минуты каждый и держать их в духовке при 60 градусах Цельсия в течение 30 минут. Погрузите образцы в свежеприготовленный раствор аспартата свинца и инкубируете их в духовке, установленной при 60 градусах Цельсия, в течение 20 минут.

Готовят эпоксидную смолу. Взвесьте ингредиенты и хорошо перемешайте смолу в течение не менее 30 минут, прежде чем добавлять ускоритель DMP 30. Готовят вирус с градуированной разведением этанола.

Затем доберите образцы из духовки и снова вымойте их двойной дистиллированной водой пять раз в течение трех минут каждый. Тем временем смешайте смолу со 100% этанолом в пропорции один к одному, чтобы получить 50% смолу. Хорошо перемешать.

После этого обезвоживают образцы в каждом разведении этанола в течение пяти минут. Помните, что образцы никогда не должны полностью высыхать. Проникайте в образцы сначала в 50% смолу в течение 30 минут, затем в 100% смолу в течение одного часа, а затем снова в свежую 100% смолу на ночь.

На следующий день поместите образцы в свежую 100% смолу на один час, а затем вставьте их между листами встраивания фторполимера. Подготовьте кусочки встраиваемого листа, которые были смазаны этанолом, и отложите в сторону стеклянные слайды, которые будут использоваться в качестве поддержки. Поместите кусок встраиваемого листа на стеклянную горку, нанесите на него каплю смолы, затем аккуратно перенесите образец с использованием деревянной палочки.

Накройте его вторым куском. Старайтесь избегать пузырьков воздуха. Будьте нежны, так как ткань очень хрупкая.

Осторожно поместите еще один стеклянный слайд поверх куска встраиваемого листа и отвержьте образец в духовке при 70 градусах Цельсия в течение не менее 48 часов. Отделите слои и вырежьте кусок встроенного образца лезвием бритвы. Перенесите его в парафин.

Это позволит свести к минимуму опасность потери образца из-за электростатики. Возьмите алюминиевый штифт, который был смазан этанолом. Смешайте проводящий эпоксидный колодец и используйте небольшое его количество, чтобы закрепить образец на штифте.

Отверждаем проводящей эпоксидной смолой при 70 градусах Цельсия в течение 10 минут. Обрежьте каждую сторону блока образца алмазным ножом, а затем отполируйте лицевую часть блока до тех пор, пока ткань не подвергется воздействию. Измельчите образец на штифт с помощью проводящей краски и отверждим его.

Чтобы свести к минимуму зарядку, образцы также должны быть покрыты тонким слоем золота или золотого палладия. Поместите штифт с образцом в камеру серийного блочного сканирующего электронного микроскопа. Выровняйте образец по ножу, затем закройте камеру и задайте параметры.

Соберите стопку изображений. С помощью описанного метода были получены изображения мозговой ткани мыши. Было сделано большое изображение гиппокампа одной области, и изображение было установлено в центре луща радиата.

Была получена стопка изображений и сегментированы объекты интереса, такие как дендритные шипы и синапсы. Морфология тканей хорошего качества была получена с хорошо видимыми мембранами и синаптическими везикулами и хорошо сохранившимися митохондриями. Иммунофлуоресцентные исследования антител PSD 95 подтвердили, что легкая первичная фиксация и традиционная фиксация с 4% PFA дают сопоставимые результаты.

Представленный протокол позволяет получать изображения тканей головного мозга с использованием серийной блочной сканирующей электронной микроскопии, высококачественной морфологии тканей, а 12 видимых мембран облегчают 10 правой сегментации и реконструкции. Моя первичная фиксация позволила использовать один и тот же мозг для анализа иммунофлуоресценции PSD 95 и электронной микроскопии, визуализирующей дендритные шипы. Здесь мы используем PSE 9, 500 budding.

Тем не менее, другой может быть использован также.