Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)

At studere integrerede membranproteiner i deres oprindelige miljø har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet. Giant unilamellar lipid vesikler, eller GUVs, er en af de mest fremtrædende platforme til at studere biomembrane egenskaber, og de kan manipuleres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af protein indarbejdet GUVs baseret på spontan inkorporering, efter hydrogel hævelse. Traditionelle metoder til fremstilling af GUV’er kan ikke generalisers for integreret membranproteininkorporering. Disse metoder er ofte lavt udbytte, metodisk komplekse og ad hoc, ikke gælder for brede klasser af proteiner. På den anden side repræsenterer denne protokol en fleksibel, robust og enkel metode til at indarbejde funktionelle integrerede membranproteiner i GUVs.Vi opnåede dette ved at forberede et hydrogel stillads, der indeholder proteinet, og deponere et tyndt lag lipid oven på det. I det eksempel, der præsenteres her, vi indarbejdet G protein-koblet receptor, eller GPCR, i GUVs.Upon rehydrering af hele systemet, GUVs bud ud af overfladen af hydrogel med membranen indeholder korrekt orienteret GPCRs.Tillad alle reagenser til at komme til stuetemperatur. I løbet af denne tid skal dækslet glide ved at placere dem i methanol og sonikering i 30 minutter ved 40