Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה
Chapters
Summary February 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר משקעי חלבונים מבוססי ממסים בתנאים מבוקרים להתאוששות וטיהור חזקים ומהירים של דגימות פרוטאום לפני ספקטרומטריית מסות.
Transcript
פרוטוקולים אלה נועדו למקסם את ההתאוששות, כמו גם את טוהר החלבונים באמצעות משקעים מבוססי ממסים. אנחנו הולכים להראות לך כמה טריקים כדי לבצע משקעים בקבוקונים, כמו גם גישה חצי אוטומטית בפורמט מחסנית ספין. כמו כן, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול המשקעים כך שיהיה עקבי ומהיר.
הפרוטוקול כולו לוקח רק כמה דקות. פרוטוקולים אלה מראים כי משקעים ממסים של חלבונים הם אידיאליים להכנת דגימות לפני ספקטרומטריית מסות. הפרוטוקולים יתאימו בצורה חלקה לתזרימי עבודה מקצועיים מלמטה למעלה, כמו גם מלמעלה למטה.
מדגימים עבורנו היום יהיו זיהנג דנג וויקטוריה מילר, מדענית בכירה ב- Proteoform Scientific בהליפקס, נובה סקוטיה פיפטה 90 מיקרוליטר של תמיסת חלבון ללא חלקיקים לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו פוליפרופילן. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי מימי אחד ו-400 מיקרוליטרים של אצטון לתמיסת הדגימה, כבשו והקישו על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. אפשרו לבקבוקון לדגור אותו.
טמפרטורת החדר ללא הפרעה במשך מינימום של שתי דקות לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות לציין את הכיוון של הבקבוקון להסתובב במשך מינימום של שתי דקות ב 10, 000 RCF או גבוה יותר בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, כדור לבן גלוי נצפה בתחתית הצינור. בשלב זה, פתח את הצינור ושקע את הסופרנט למיכל פסולת על ידי היפוך הצינור.
השתמש במגבת נייר כדי לשאוב כל ממס שיורי מהבקבוקון. עבור SDS המכיל דוגמאות. בזהירות לחלק 400 microliters של אצטון טרי מבלי להפריע את הכדור.
מיד centrafuse את הדגימה במשך דקה אחת ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר על ידי הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. ציין את ממס הכביסה כפי שתואר קודם לכן. יבשו את הדגימה כשהפקק פתוח למשך כדקה.
במכסה אדים, לפני סולובילזציה של גלולה. יש לחלק 100 מיקרוליטר מתמיסת החלבון לתוך בקבוקון פוליפרופילן. במכסה האדים מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מתנול ואחריהם 100 מיקרוליטרים של כלורופורם.
מכסים את הבקבוקון והמערבולת לזמן קצר כדי לערבב. יש לטפטף במהירות 300 מיקרוליטרים של מים ישירות למרכז הבקבוקון. מכסים את הבקבוקון ומאפשרים לו לשבת על הספסל ללא הפרעה למשך דקה אחת, לאחר מניחים את בקבוקון הפוליפרופילן בצנטריפוגה ומסובבים אותו במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר.
הבקבוקון הוא ציין שיש שתי שכבות ממס וכדור לבן גלוי עד הבקבוקון בערך 45 מעלות. הסר כ -700 מיקרוליטר של הממס מהשכבה העליונה בקצב אחיד באמצעות קצה מיקרו פיפטה גדול של מיליליטר אחד בתחילה ומאוחר יותר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עד שהוא יוצר חרוז בבקבוקון. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מתנול טרי לבקבוקון הדגימה מבלי להפריע לכדור על ידי חלוקת הממס במורד דופן הבקבוקון.
מכסים את הבקבוקון ומשלבים את שכבות הממס על ידי נדנדה עדינה של הבקבוקון כדי לסובב את הממסים יחד. כדי לבחון את כדור החלבון הלבן המציין את הכיוון של הבקבוקון בצנטריפוגת הרוטור במשך מינימום של 10 דקות ב 10, 000 פעמים G ומעלה בטמפרטורת החדר. זווית את הבקבוקון כאשר הכדור פונה כלפי מטה.
מניחים קצה פיפטה לאורך הקצה העליון של הבקבוקון ומסירים את הסופרנטנט עם קצה מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד בקצב איטי אך אחיד. שמירה על כ 20 מיקרוליטר של ממס. אפשרו לשאריות הממס להתייבש במכסה האדים.
כדי לזרז את החלבון. באמצעות מחסנית סינון חד פעמית חבר את התקע למחסנית הסינון העליונה. שלב 90 מיקרוליטר של תמיסת חלבון 10 מיקרוליטר של שומה אחת אקווה, נתרן כלורי ו 400 מיקרוליטר של אצטון.
דגירה במשך שתי דקות לפחות על הספסל, צנטריפוגה של דגימת חלבון מוכן עם התקע עדיין מחובר למחסנית הסינון במשך שתי דקות ב 2, 500 פעמים G.At טמפרטורת החדר, להפוך את המחסנית ולפתוח ולהסיר את התקע מבסיס המחסנית. הניחו את מחסנית הסינון בצנטריפוגה נקייה של דגימת החלבון למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 500 פעמים G בטמפרטורת החדר. השליכו את הזרימה דרך הממס מהבקבוקון התחתון.
לשטוף את גלולת החלבון על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של אצטון למחסנית הסינון, צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 500 פעמים G בטמפרטורת החדר או עד שלא נשאר ממס במחסנית העליונה. בעקבות פרוטוקולי משקעי החלבון שהודגמו בעבר. ניתן לבודד מחדש את החלבון על ידי הרטבת הממברנה בבסיס מחסנית הסינון על ידי חלוקת שניים עד חמישה מיקרוליטרים של ISO פרופנול ישירות לממברנה מיד לפני שממשיכים לפרוטוקול ה-re solubilization ל-re solubilization של גלולת החלבון להכין 80% נפח לפי נפח תמיסה של חומצה פורמית במים.
מצננים מראש את תמיסת החומצה הזו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ואת מחסנית הסינון המכילה חלבון משופע. יש לפזר 50 מיקרוליטר של חומצה פורמית מדוללת קרה לתוך מכסה המחסנית המצונן והמערבולת למשך 30 שניות. החזירו את מחסנית הסינון למקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
חזור על שלבי המערבולת והדגירה הקודמים. הוסיפו 450 מיקרוליטרים של מים לנפח סופי של 500 מיקרוליטרים. דילול החומצה הפורמית ל-8% הפוך את ביטול ההברגה של המחסנית, הסר את התקע מבסיס המחסנית וחבר את מחסנית ה-SPE לבקבוקון.
סובב את החלבון דרך מחסנית SPE בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב 800 פעמים G.אם הממס נשאר במחסנית העליונה להחזיר את המחסנית לצנטריפוגה ולחזור על הסחיטה. יש לשטוף על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של 5% אצטוניטריל עם 0.1% TFA במים למחסנית SPE, לזרום דרך מחסנית SPE במשך שתי דקות במחיר של 2000 פעמים G.עבור חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך או פפטידים מעוכלים יש לחמוק מהדגימה על ידי הזרמת 300 מיקרוליטר. אצטוניטריל 50% עם 0.1% TFA למשך חמש דקות ב-2, 500 פעמים G.לחלבונים שלמים.
המשך עם שלב חמקמקות נוסף באמצעות 300 מיקרוליטרים של 75% אצטוניטריל עם 0.1% חומצה סגפנית Trifluoro. שלבו את שתי התמציות המתקבלות. האיור משווה את דלדול ה-SDS בעקבות בקבוקון מבוסס או משקעים של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית.
שימוש באצטון עם פרוטוקולי המהירות וה-CMW הקונבנציונליים. כל הגישות מפחיתות את ה-SDS כדי לאפשר ניתוח אופטימלי של ספקטרומטריית מסות. איור זה מראה התאוששות כמותית של חלבונים על-ידי מעקב אחר משקעי אצטון מהירים ומשקעי CMW באמצעות ניתוח דף SDS של ליזאט תאי כולל של שמרים מעובדים.
התאוששות עקבית הושגה עם כל פרוטוקולי המשקעים. משקעים במחסנית סינון חד פעמית מבטלים את הצורך בפיפטציה זהירה של SDS המכילה סופרנטנט תוך שמירה על החלבונים המצטברים מעל מסנן ממברנה. לפיכך לא זוהו פסים נראים לעין בשברים העל-טבעיים על פני שלושה שכפולים עצמאיים.
משקעי החלבון המבוססים על מחסנית מדגימים התאוששות מעולה של דגימה מעוכלת של פפסין של פלזמת בקר ביחס למשקעים על בסיס בקבוקונים. הבדלים משמעותיים יותר בתפוקה מצוינים במחסנית כאשר שימוש בנתרן כלורי תוך שימוש בממס אבץ הביא לתפוקה הגבוהה ביותר. נתון זה מכמת את עוצמת שיא הפפטידים מכל דגימת פפטיד עם יחס מעל אחד המשקף שפע פפטידי גבוה יותר עבור דגימות המעובדות במחסניות המסנן החד פעמיות.
האיור משווה את מספר הפפטידים שזוהו לכל חלבון בשלושת תכשירי הדגימה המשוכפלים. מקדמי המתאם של 0.94 עד 0.95 בגרפים אלה מדגימים את העקביות הגבוהה של גישת הכנת הדגימה לניתוח ספקטרומטריית מסות מלמטה למעלה. אז ברגע שהכדור הזה נוצר אתה באמת רוצה להימנע מלהפריע לו.
אם תשמור אותו ככדור שלם תקבל תשואה גבוהה יותר. אז הקפידו לא לשכוח לשטוף את הכדור הזה עם תוספת אצטון. זה מוודא שאנחנו נפטרים מה-SDS ששומר על הדגימה שלנו נקייה ככל האפשר וזה נותן לנו את ניתוח ספקטרומטריית המסות הטוב ביותר.
אז מצאנו שהסרת הממס העודף על ידי היפוך היא הרבה יותר פשוטה מאשר לנסות לקטר את הדגימה. בדרך זו תקבלו תשואות עקביות יותר. ביצוע משקעי אצטון בטמפרטורת החדר הביא להתאוששות עקבית ומהירה יותר מאשר משקעים מסורתיים במקפיא.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
