Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले मजबूत प्रोटिओम शुद्धिकरण के लिए कार्बनिक विलायक-आधारित प्रोटीन वर्षा
Chapters
Summary February 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
वर्तमान प्रोटोकॉल मजबूत और तेजी से वसूली और मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले प्रोटिओम नमूनों की शुद्धि के लिए नियंत्रित परिस्थितियों में विलायक आधारित प्रोटीन वर्षा का वर्णन करता है।
Transcript
इन प्रोटोकॉल वसूली के रूप में अच्छी तरह से विलायक आधारित वर्षा के माध्यम से प्रोटीन की शुद्धता को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं। हम आपको शीशियों में वर्षा करने के लिए कुछ चालें दिखाने जा रहे हैं, साथ ही स्पिन कारतूस प्रारूप में एक अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण भी। हमने वर्षा प्रोटोकॉल को सुसंगत और त्वरित होने के लिए भी अनुकूलित किया है।
पूरे प्रोटोकॉल में केवल कुछ मिनट लगते हैं। ये प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं कि प्रोटीन की विलायक वर्षा मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले नमूना तैयार करने के लिए आदर्श है। प्रोटोकॉल नीचे ऊपर और ऊपर नीचे प्रो वर्कफ़्लो में निर्बाध रूप से फिट होंगे।
आज हमारे लिए प्रदर्शन जिहेंग डांग और विक्टोरिया मिलर, हैलिफ़ैक्स में प्रोटियोफॉर्म साइंटिफिक में वरिष्ठ वैज्ञानिक, नोवा स्कोटिया पिपेट 90 माइक्रोलीटर एक पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में पार्टिकुलेट मुक्त प्रोटीन समाधान के 90 माइक्रोलीटर होंगे। फिर नमूना समाधान में एक तिल जलीय सोडियम क्लोराइड के 10 माइक्रोलीटर और एसीटोन के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, सॉल्वैंट्स को संयोजित करने के लिए शीशी को धीरे-धीरे कैप और टैप करें। शीशी को इसे सेते रहने दें।
इनक्यूबेशन के बाद कम से कम दो मिनट के लिए कमरे का तापमान, शीशी के उन्मुखीकरण को ध्यान में रखते हुए नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और कमरे के तापमान पर 10,000 आरसीएफ या उससे अधिक पर कम से कम दो मिनट के लिए स्पिन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूब के तल पर एक दृश्यमान सफेद गोली देखी जाती है। इस बिंदु पर, ट्यूब को अनकैप करें और ट्यूब को उलटकर एक अपशिष्ट कंटेनर में सुपरनेट को डिकैंट करें।
शीशी से किसी भी अवशिष्ट विलायक को आकर्षित करने के लिए एक पेपर तौलिया का उपयोग करें। नमूनों वाले एसडीएस के लिए। गोली को परेशान किए बिना ताजा एसीटोन के 400 माइक्रोलीटर सावधानीपूर्वक वितरित करें।
प्रारंभिक स्पिन के समान अभिविन्यास में रोटर में शीशी रखकर कमरे के तापमान पर 10, 000 गुना जी या उससे अधिक पर एक मिनट के लिए नमूना तुरंत केन्द्रित करें। पहले वर्णित के रूप में धोने विलायक को डीकाउंट करें। लगभग एक मिनट के लिए खुली टोपी के साथ नमूना सूखी।
एक धूआं हुड में, एक गोली घुलनशीलता से पहले। एक पॉलीप्रोपाइलीन शीशी में प्रोटीन समाधान के 100 माइक्रोलीटर वितरित करें। धुएं के हुड में, मेथनॉल के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोलीटर।
मिश्रण करने के लिए शीशी और भंवर को संक्षेप में कैप करें। जल्दी से शीशी के केंद्र में सीधे 300 माइक्रोलीटर पानी वितरित करें। शीशी को कैप करें और इसे एक मिनट के लिए बेंच टॉप पर बैठने की अनुमति दें, पॉलीप्रोपाइलीन शीशी को एक अपकेंद्रित्र में रखने के बाद और कमरे के तापमान पर 10, 000 गुना जी या उससे अधिक पर पांच मिनट के लिए स्पिन करें।
शीशी में दो विलायक परतें और लगभग 45 डिग्री पर शीशी तक एक दृश्यमान सफेद गोली देखी जाती है। एक बड़ी एक मिलीलीटर माइक्रो विंदुक टिप शुरू में और बाद में एक 200 माइक्रोलीटर विंदुक टिप के साथ एक समान दर पर ऊपरी परत से विलायक के लगभग 700 माइक्रोलीटर निकालें जब तक कि यह शीशी में एक मनका बनाता है। शीशी के किनारे विलायक को वितरित करके गोली को परेशान किए बिना नमूना शीशी में ताजा मेथनॉल के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें।
शीशी को कैप करें और सॉल्वैंट्स को एक साथ घुमाने के लिए शीशी को धीरे-धीरे रॉक करके विलायक परतों को संयोजित करें। सफेद प्रोटीन गोली का निरीक्षण करने के लिए कमरे के तापमान पर 10,000 गुना जी या उससे अधिक पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए रोटर अपकेंद्रित्र में शीशी के उन्मुखीकरण को ध्यान में रखते हुए। नीचे का सामना करना पड़ गोली के साथ शीशी कोण।
शीशी के ऊपरी किनारे के साथ एक पिपेट टिप रखें और धीमी लेकिन समान दर पर एक मिलीलीटर माइक्रो पिपेट टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। विलायक के लगभग 20 माइक्रोलीटर को बनाए रखना। अवशिष्ट विलायक को धूआं हुड में सूखने दें।
प्रोटीन को अवक्षेपित करना। डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस का उपयोग करके प्लग को ऊपरी निस्पंदन कारतूस में संलग्न करें। प्रोटीन समाधान के 90 माइक्रोलीटर एक तिल एक्वास के 10 माइक्रोलीटर, सोडियम क्लोराइड और एसीटोन के 400 माइक्रोलीटर मिलाएं।
बेंच टॉप पर कम से कम दो मिनट के लिए सेते हैं, प्लग के साथ तैयार प्रोटीन नमूने को अपकेंद्रित्र अभी भी कमरे के तापमान के 2, 500 गुना पर दो मिनट G.At निस्पंदन कारतूस से जुड़ा हुआ है, कारतूस और अनस्क्रू को उलटा करें और कारतूस बेस से प्लग को हटा दें। कमरे के तापमान पर 500 गुना जी पर तीन मिनट के लिए प्रोटीन नमूना एक साफ शीशी अपकेंद्रित्र में निस्पंदन कारतूस रखें। निचली शीशी से विलायक के माध्यम से प्रवाह को त्यागें।
निस्पंदन कारतूस में एसीटोन के 400 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रोटीन गोली को धो लें, कमरे के तापमान पर 500 गुना जी पर तीन मिनट के लिए अपकेंद्रित्र या ऊपरी कारतूस में कोई विलायक न रह जाए। पहले से प्रदर्शित प्रोटीन वर्षा प्रोटोकॉल के बाद। प्रोटीन गोली के पुन: घुलनशीलता के लिए पुन: घुलनशीलता प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ने से ठीक पहले झिल्ली को सीधे आईएसओ प्रोपेनोल के दो से पांच माइक्रोलीटर वितरित करके निस्पंदन कारतूस के आधार पर झिल्ली को गीला करके प्रोटीन को फिर से घुलनशील बनाएं पानी में फॉर्मिक एसिड के वॉल्यूम समाधान द्वारा 80% वॉल्यूम तैयार करें।
इस एसिड समाधान को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस कम पर प्री चिल करें और निस्पंदन कारतूस जिसमें अवक्षेपित प्रोटीन होता है। 30 सेकंड के लिए ठंडा कारतूस टोपी और भंवर में ठंडे पतला फॉर्मिक एसिड के 50 माइक्रोलीटर वितरित करें। निस्पंदन कारतूस को 10 मिनट के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में लौटाएं।
पिछले भंवर और इनक्यूबेशन चरणों को दोहराएं। 500 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में 450 माइक्रोलीटर पानी जोड़ें। फॉर्मिक एसिड को 8% तक पतला करना कारतूस को उलटा करें और कारतूस के आधार से प्लग को हटा दें और एसपीई कारतूस को शीशी में संलग्न करें।
एसपीई कारतूस के माध्यम से प्रोटीन को कमरे के तापमान पर एक अपकेंद्रित्र में 800 बार जी पर पांच मिनट के लिए स्पिन करें यदि ऊपरी कारतूस में विलायक रहता है तो कारतूस को अपकेंद्रित्र में वापस करें और स्पिन दोहराएं। एसपीई कारतूस में पानी में टीएफए के 0.1% के साथ 5% एसिटोनिट्राइल के 300 माइक्रोलीटर जोड़कर कुल्ला, एसपीई कारतूस के माध्यम से 2000 गुना जी पर दो मिनट के लिए प्रवाहित करें कम आणविक भार प्रोटीन या पचा पेप्टाइड्स के लिए 300 माइक्रोलीटर बहकर नमूना निकालें। बरकरार प्रोटीन के लिए 2, 500 गुना जी पर पांच मिनट के लिए टीएफए के 0.1% के साथ 50% एसिटोनाइट्राइल।
0.1% ट्राइफ्लोरो तपस्वी एसिड के साथ 75% एसिटोनाइट्राइल के 300 माइक्रोलीटर का उपयोग करके एक अतिरिक्त वाषण चरण के साथ पालन करें। दो परिणामी अर्क को मिलाएं। यह आंकड़ा डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस में शीशी आधारित या प्रोटीन की वर्षा के बाद एसडीएस की कमी की तुलना करता है।
पारंपरिक तेजी से और सीएमडब्ल्यू प्रोटोकॉल के साथ एसीटोन का उपयोग करना। सभी दृष्टिकोण इष्टतम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एसडीएस को कम करते हैं। यह आंकड़ा एक संसाधित खमीर कुल सेल लाइसेट के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के माध्यम से तेजी से एसीटोन वर्षा और सीएमडब्ल्यू वर्षा का पालन करके मात्रात्मक प्रोटीन वसूली दिखाता है।
सभी वर्षा प्रोटोकॉल के साथ लगातार वसूली प्राप्त की गई थी। एक डिस्पोजेबल निस्पंदन कारतूस में वर्षा एक झिल्ली फिल्टर के ऊपर एकत्रित प्रोटीन को बनाए रखते हुए सतह पर तैरनेवाला युक्त सावधानीपूर्वक पिपेट एसडीएस की आवश्यकता को समाप्त करती है। इस प्रकार तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों में सतह पर तैरनेवाला अंशों में कोई दृश्यमान बैंड नहीं पाया गया।
कारतूस आधारित प्रोटीन वर्षा शीशी आधारित वर्षा के सापेक्ष गोजातीय प्लाज्मा के पेप्सिन पचने वाले नमूने की बेहतर वसूली को दर्शाती है। जस्ता विलायक को नियोजित करते समय सोडियम क्लोराइड को नियोजित करते समय कारतूस में उपज में अधिक महत्वपूर्ण अंतर नोट किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप उच्चतम उपज होती है। यह आंकड़ा डिस्पोजेबल फिल्टर कारतूस में संसाधित नमूनों के लिए एक उच्च पेप्टाइड बहुतायत को दर्शाते हुए एक से ऊपर के अनुपात के साथ प्रत्येक पेप्टाइड नमूने से पेप्टाइड चोटी की तीव्रता को मापता है।
यह आंकड़ा तीन प्रतिकृति नमूना तैयारियों में प्रति प्रोटीन पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या की तुलना करता है। इन रेखांकनों में 0.94 से 0.95 के सहसंबंध गुणांक नीचे अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी दृष्टिकोण की उच्च स्थिरता प्रदर्शित करते हैं। तो एक बार जब वह गोली बन जाती है तो आप वास्तव में इसे परेशान करने से बचना चाहते हैं।
यदि आप इसे एक बरकरार गोली के रूप में रखते हैं तो आपको उच्च उपज मिलेगी। तो सुनिश्चित करें कि अतिरिक्त एसीटोन के साथ उस गोली को धोना न भूलें। यह सुनिश्चित कर रहा है कि हम अपने नमूने को यथासंभव साफ रखते हुए एसडीएस से छुटकारा पा रहे हैं और यह हमें सबसे अच्छा मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण देता है।
तो हमने पाया कि उलटा द्वारा अतिरिक्त विलायक को हटाने से नमूना पिपेट करने की कोशिश करने की तुलना में बहुत आसान है। आपको इस तरह से अधिक सुसंगत पैदावार मिलेगी। कमरे के तापमान पर एसीटोन वर्षा करने से फ्रीजर में पारंपरिक वर्षा की तुलना में अधिक सुसंगत और तेजी से वसूली हुई।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
